Summary
Croci sessuali e isolamento della progenie ricombinante sono strumenti di ricerca importanti per il fungo filamentoso,
Abstract
Fusarium graminearum è diventato un sistema modello per gli studi nello sviluppo e la patogenicità dei funghi filamentosi. F. graminearum più facilmente produce corpi fruttiferi, detti periteci, su agar carota. Periteci contengono numerosi tipi di tessuti, prodotti in determinate fasi dello sviluppo perithecium. Questi includono (in ordine di apparizione) formazione delle iniziali perithecium (che dà luogo a ife ascogenous), il muro esterno, paraphyses (miceli sterili che occupano il centro della perithecium fino al ASCI sviluppo), l'ASCI, e le ascospore all'interno aschi 14. Lo sviluppo di ciascuno di questi tessuti è separato da circa 24 ore ed è stata la base di studi trascrittomica durante lo sviluppo sessuale 12,8. Fare riferimento alla Hallen et al. (2007) per una descrizione più approfondita di sviluppo, comprese le fotografie di ogni tappa. Qui vi presentiamo i metodi per la generazione e la raccolta sincronamente lo sviluppo di prati di periteci per gli studi temporali di regolazione genica, sviluppo e processi fisiologici. Sebbene questi metodi sono scritti specificamente per essere utilizzato con F. graminearum, le tecniche possono essere utilizzate per una varietà di altri funghi, purché fruttificazione può essere indotta in coltura e vi è una certa sincronia di sviluppo. Di recente abbiamo adattato questo protocollo per studiare lo sviluppo sessuale di F. verticillioides. Anche se periteci individuo deve essere raccolte a mano in questa specie, a causa di un prato in via di sviluppo periteci non poteva essere indotta, il processo ha funzionato bene per lo studio dello sviluppo (Sikhakolli e Trail, inedito).
La funzione più importante di corpi fruttiferi fungini è la dispersione delle spore. In molte delle specie di Ascomycota (asco produrre funghi), spore vengono sparati da asco, a causa della generazione di pressione all'interno del turgore asco, guida espulsione di spore (e fluido epiplasmic) attraverso l'pori nella punta asco 2,7. I nostri studi di scarico forzato ascospore hanno portato allo sviluppo di un "test di scarico spore", che usiamo per lo screening di mutazioni nel processo. Qui vi presentiamo i dettagli di questo test.
F. graminearum è homothallic, e quindi possono formare corpi fruttiferi in assenza di un partner compatibile. Il vantaggio di homothallism è che la traversata non è necessario generare prole omozigote per un carattere particolare, un aspetto che ha facilitato lo studio dello sviluppo sessuale in questa specie 14,7. Tuttavia, heterothallic ceppi sono stati generati che possono essere utilizzati per l'attraversamento 5,9. È anche possibile attraversare ceppi homothallic ottenere mutanti dei geni diversi in un unico ceppo 1. Questo viene fatto coinoculating un piatto Petri con 2 ceppi. Lungo il punto di incontro, la maggioranza dei periteci sarà ricombinante (fornita una mutazione in uno dei ceppi madri non inibisceincroci). Con l'età periteci, trasudano ascospore in massa, invece di forza li scarica. L'essudato spore risultante (chiamato cirrhus) si trova sulla punta del perithecium e può essere facilmente rimossa per il recupero di spore individuali. Qui vi presentiamo un protocollo per facilitare l'identificazione dei periteci ricombinante e il recupero della progenie ricombinante.
Protocol
1. Produrre periteci
- Centro carota agar inoculare 10 in un piatto diam 6,0 centimetri Petri con un ceppo di F. fertile graminearum (Consiglia PH-1).
- Luogo inoculato piatti sotto brillanti luci fluorescenti a temperatura ambiente (18-24 ° C) e lasciar crescere fino micelio ha raggiunto il bordo esterno del piatto Petri (3-5 giorni). Luci fluorescenti per la casa commerciali funzionano bene per stimolare la formazione del corpo fruttifero e di scarico.
- Rimuovere delicatamente il micelio aereo con uno stuzzicadenti sterile.
- Distribuire 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq alla superficie con un hockeystick vetro sterile o estremità arrotondata di una bacchetta di vetro sterile.
- Torna piastre alla luce. Non aggiungere Parafilm alle piastre.
- Dopo 24 ore, la superficie delle piastre dovrebbe avere un aspetto brillante. Se miceli riappare, superficie raschiare e riapplicare Tween-60 soluzione.
- Osservare lo sviluppo di periteci la prossima settimana. Le fasi intermedie diperithecium sviluppo può essere raccolto da delicatamente raschiatura della superficie del agar e flash congelati per estrazione di RNA (Figura 1).
- Spore mature si accumulano sul coperchio della piastra di giorno 7. Inizialmente queste saranno visibili sotto un microscopio per dissezione, ma di giorno 9, che si sono accumulati a densità sufficiente in modo da essere visibili a occhio nudo.
2. Ascospore scarico Assay
- Il giorno 6 dopo l'applicazione della soluzione di Tween, tagliare un cerchio di diametro 1 cm dal agar con un piralide legno. In alternativa, un bisturi può essere usato per rimuovere un segmento di dimensioni analoghe. Il cerchio può essere tagliati a metà e ciascuna metà posta su un vetrino per microscopio.
- Orientare i pezzi così la superficie contenente i corpi fruttiferi è perpendicolare alla superficie della slitta, e le spore vengono sparati lungo la lunghezza della slitta.
- Mettere il vetrino in una camera umida per tutta la notte sotto le luci. Le spore si accumulano sullala slitta ed essere visibile ad occhio nudo la mattina seguente (figura 2).
- Spore accumulate possono essere lavati dal vetrino con acqua e quantificati se lo si desidera.
- Potenziali inibitori scarico ascospora può essere saggiata aggiungendoli alla parte posteriore del blocco agar durante l'assemblaggio del saggio. Alcuni inibitori del canale ionico che riducono scarico sono stati precedentemente esaminati con questa tecnica 15.
3. Generazione di Progeny ricombinante
- Avviare attraversare inoculando agar di carote con due ceppi di F. graminearum (uno Nit + e uno nit-), ponendo i punti di inoculazione su lati opposti della piastra di Petri.
- Dopo aver riempito la ife superficie, raschiare porzione aerea e applicare Tween-60 soluzione come descritto sopra. Utilizzare un marcatore notare sul lato della piastra Petri dove ife incontrano.
- Torna culture alla luce e incubare fino periteci hanno sviluppato, e hanno cirrhi esserepistola a formare dal periteci lungo l'intersezione tra le due culture.
- Sotto il microscopio da dissezione, mettono in visualizzare il periteci lungo l'intersezione delle due culture. L'utilizzo di un pin insetto, sterilizzato e immerso in acqua sterile, toccare un cirrhus lungo questo confine con la punta del perno. L'umidità del perno dovrebbe consentire alle cirrhus ad attaccarsi al perno.
- Lavare la punta del perno con i cirrhus su di esso in 200 microlitri di acqua sterile in un tubo Eppendorf a lavare le spore.
- Flame il perno, si inumidire di nuovo e scegliere un altro cirrhus. Molto 10-15 cirrhi, e posizionare ciascuno in un tubo separato di acqua.
- Brevemente i tubi vortex in sospensione cirrhi.
- Rimuovere 60 pl di sospensione di spore con una pipetta e posto sul terreno MMTS 1 in una capsula Petri cm 9. Stendere con una mazza da hockey sterile. La sospensione di spore rimanente può essere conservato a 4 ° C per una settimana e ripiastrate se necessario.
- IncubaTE a temperatura ambiente (luce non necessaria) per 3-5 giorni fino colonie molto piccole (Figura 3). Ci saranno due tipi di fenotipi tra le colonie. I nit-colonie avrà ife rada di colonie + il NIT. Cirrhi da ricombinante periteci mostrerà entrambi i fenotipi di colonie in proporzione approssimativamente uguale. Gettare le piastre con colonie di solo un fenotipo singolo su di loro. Si noti che a volte più di due fenotipi risultare a causa della segregazione di altri fattori.
- Spostare colonie V8 o agar carota per lo stoccaggio. Colonie di test su Agar Dox Czapek (le nit di ceppi non cresce su Dox Czapek) e su PDA con clorato (0,5 M clorato di potassio, i ceppi + Nit non crescono su PDA con Clorato) per confermare il fenotipo corretta. Esaminare queste colonie per le qualità desiderate.
4. Risultati rappresentativi
Produrre periteci
L'obiettivo è quello di avere un prato diperiteci senza miceli o spore apparenti. La superficie della coltura sarà simile a velluto nero (Figura 1). A 24 ore dopo l'applicazione di Tween superficie del agar dovrebbe avere una leggera lucentezza. Se miceli riapparire, poi la targa non può essere stato raschiato a sufficienza per indurre lo sviluppo perithecium.
Ascospore di scarico
Fornire sempre nel vostro test diversi blocchi di agar dal ceppo di tipo selvatico. Se questi non vengono attivati, quindi sia i periteci sono troppo giovani o troppo vecchi. Se sono troppo vecchio, quindi ife numerosi apparirà sulla superficie della cultura dando una tonalità biancastra. Se questo non è il caso, essi possono essere troppo giovane, e il saggio deve essere nuovamente processato in 24 ore. Di tanto in tanto, le culture non si scaricano bene, e l'esperimento dovrà essere ripetuto. Assicurati di eseguire il test in base alle condizioni di luce adeguate.
Progenie ricombinante
Figura 1. Fasi di sviluppo perithecium su agar carota. Sinistra, 72 h dopo l'applicazione di Tween. Nota pigmento rosso e periteci giovanissimo visibile come grani nere sulla superficie. A destra, a 144 h, periteci maturi si sono formate. Nota quasi completa assenza di miceli superficiale in entrambe le culture.
Figura 2. Scarico saggio. L'arancio spina agar carota è orientata in modo thaspore t forzatamente scaricate dal periteci maturo sulla sua superficie può accumularsi sulla superficie del vetrino. 15 ore tempo di accumulo.
Figura 3. Le differenze di crescita tra + e Nit nit-colonie sul terreno selettivo MMTS. I nit-colonie (punte di freccia) sono più piccoli. Le colonie + NIT (frecce) mostrano una crescita robusta. Fotografia scattata dopo 7 giorni.
Discussion
F. graminearum è particolarmente adatto per lo studio di sviluppo fruttificazione corpo grazie alla disponibilità di una ben annotato genoma ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , 4), e la disponibilità di un Affymetrix, basato microarray 6. Questo ha facilitato la capacità di identificare i geni importanti per lo scarico ascospore 7,11,3. I metodi qui presentati permetteranno al ricercatore di concentrarsi su un insieme discreto di stadi di sviluppo e le funzioni per l'analisi genetica dei corpi fruttiferi di F. graminearum. I metodi sono inoltre facilmente adattabili a funghi correlati che possono essere indotte a frutta in coltura, e può essere utilizzato come standard per lo sviluppo in una varietà di tipi fruttiferi altri fungine corpo.
La capacità di valutare un fenotipo spore di cottura può essere sottile nelle specie in cui spore sono piccole e difficili da vedere, come
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (MCB-0.923.794 a FT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
References
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