Summary
Sexuella kors och isolering av rekombinant avkomma är viktiga forskningsverktyg för fintrådiga svamp,
Abstract
Fusarium graminearum har blivit ett modellsystem för studier i utvecklingen och patogenicitet av trådformiga svampar. F. graminearum lättast producerar fruktkroppar, så kallade perithecia på morot agar. Perithecia innehåller många vävnadstyper, som produceras vid specifika stadier av perithecium utveckling. Dessa inkluderar (i ordning utseende) bildning av perithecium initialer (som ger upphov till ascogenous hyfer), den yttre väggen, Parafyserna (sterilt mycel som upptar mitten av perithecium tills ASCI utvecklas), den Ascl, och ascosporer inom asci 14. Utvecklingen av var och en av dessa vävnader separeras med ca 24 timmar och har legat till grund för transcriptomic studier under sexuell utveckling 12,8. Se Hallen et al. (2007) för en mer ingående beskrivning av utvecklingen, inklusive fotografier av varje steg. Här presenterar vi de metoder för att generera och skörd synkronaly utveckla gräsmattor perithecia för temporära studier av genreglering, utveckling och fysiologiska processer. Även om dessa metoder är skrivna specifikt för användning med F. graminearum, kan tekniker användas för en mängd olika andra svampar, förutsatt att fruktkropp kan induceras i kultur och det finns vissa synkront till utveckling. Vi har nyligen anpassat detta protokoll för att studera sexuella utvecklingen av F. verticillioides. Även om enskilda perithecia måste handplockade i denna art, eftersom en gräsmatta att utveckla perithecia inte kunde induceras fungerade processen bra för att studera utveckling (Sikhakolli och Trail, opublicerad).
Den viktigaste funktionen av svamp fruktkroppar är spridning av sporer. I många av de arter av Ascomycota (ascus producera svampar), är sporer skott från ascus, på grund av generering av saftspänningen i ascus, kör utdrivning av sporer (och epiplasmic vätska) genompor i ascus spetsen 2,7. Våra studier av påtvingat ascospore urladdning har resulterat i utvecklingen av en "spor urladdning assay", som vi använder för att screena med avseende på mutationer i processen. Här presenterar vi detaljerna i denna analys.
F. graminearum är homothallic, och därmed kan bilda fruktkroppar i avsaknad av en kompatibel partner. Fördelen med homothallism är att korsningen inte är nödvändigt att ta fram avkomma homozygot för en viss egenskap, en aspekt som har underlättat studier av sexuella utveckling i denna art 14,7. Emellertid har heterothallic stammar tagits fram som kan användas för passage 5,9. Det är också möjligt att korsa homothallic stammar för att erhålla mutanter av flera gener i en stam 1. Detta görs genom att coinoculating en Petri-skål med 2-stammar. Längs mötesplats, kommer majoriteten av perithecia vara rekombinant (förutsatt en mutation i en av de moderstammar inte hämmarkorsningspotential). Som perithecia ålder utstrålar de ascosporer en masse i stället för att med våld urladdning dem. Den resulterande sporer exsudat (kallas cirrhus) sitter i spetsen av perithecium och kan lätt tas bort för återvinning av enskilda sporer. Här presenterar vi ett protokoll för att underlätta identifieringen av rekombinant perithecia och återvinning av rekombinant avkomma.
Protocol
1. Framställning Perithecia
- Centrum inokulera morot-agar 10 i en 6,0 cm diameter Petri-skål med en fertil stam av F. graminearum (Rekommenderat PH-1).
- Placera ympade rätter under starkt lysrör i rumstemperatur (18-24 ° C) och låt växa tills mycel har nått den yttre kanten av petriskålen (3-5 dagar). Kommersiella hushåll lysrör fungera bra för att stimulera bildandet fruktkroppen och ansvarsfrihet.
- Ta försiktigt bort luftmycelium med en steril tandpetare.
- Distribuera 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq till ytan med en steril glas Hockeystick eller rundad ände av en steril glasstav.
- Återgå plattor för ljus. Lägg inte Parafilm till plattorna.
- Efter 24 h bör ytan av plattorna har ett blankt utseende. Om mycel igen, skrapa ytan och applicera Tween-60-lösning.
- Observera utveckling perithecia under nästa vecka. De mellanliggande faser avperithecium utveckling kan skördas genom att försiktigt skrapa ytan på agaren och snabbfrystes för RNA-extraktion (fig 1).
- Mogna sporer kommer att ackumulera på locket av plattan vid dag 7. Initialt de kommer bara att vara synlig under ett dissektionsmikroskop, men dag 9, kommer de att ha ackumulerats till tillräcklig täthet för att vara synlig för blotta ögat.
2. Ascospore urladdning Analys
- På dag 6 efter applicering av Tween-lösning, skär ett 1 cirkel cm diameter ur agar med en trä borr. Alternativt kan en skalpell användas för att avlägsna en liknande storlek segmentet. Cirkeln kan skivas i två halvor och varje halva placerades på en glasmikroskopskiva.
- Orient bitarna så att ytan innehåller fruktkroppar är vinkelrätt mot ytan på bilden, och sporer eldas ner längden på bilden.
- Placera objektglaset i en fuktkammare natten under lamporna. Sporer kommer att samlas påsliden och som är synliga för blotta ögat nästa morgon (figur 2).
- Ackumulerade sporer kan tvättas bort bilden med vatten och kvantifieras om så önskas.
- Potentiella ascospore urladdning inhibitorer kan analyseras genom att tillsätta dem till den bakre sidan av agar blocket under montering av analysen. Vissa jonkanal-hämmare som minskar utsläpp tidigare har analyseras med denna teknik 15.
3. Generering av rekombinant avkomma
- Initiera över genom ympning morot agar med två stammar av F. graminearum (en nit + och en nit-), att placera de inokulering punkter på motsatta sidor av en petriskål.
- När hyfer har fyllt ytan, skrapa bort antennen del och använda Tween-60-lösning som beskrivits ovan. Använda en markör för att notera på den sida av petriskålen där hyfer möts.
- Återgå kulturer ljus och inkubera tills perithecia har utvecklats och cirrhi har attpistolen för att bilda den perithecia längs skärningen mellan de två kulturerna.
- Under dissekeringsmikroskop sätta i visa perithecia längs skärningspunkten mellan de två kulturerna. Med en insekt stift, steriliseras och doppas i sterilt vatten, tryck en cirrhus längs denna gräns lätt med spetsen på stiftet. Fukten på tappen bör tillåta cirrhus att fastna på tappen.
- Skölj spetsen på stiftet med cirrhus på det i 200 | il sterilt vatten i ett Eppendorf-rör för att tvätta de sporer av.
- Flame stiftet, fukta den igen och välja ett annat cirrhus. Plocka 10 till 15 cirrhi och placera var och en i ett separat rör av vatten.
- Kortfattat vortexrör innehållande suspenderade cirrhi.
- Avlägsna 60 pl av sporsuspensionen med en pipett och placera på mMTS mediet 1 i en 9 cm Petriskål. Sprids med en steril hockeyklubba. Den återstående sporsuspension kan förvaras vid 4 ° C under upp till en vecka och återutströks om nödvändigt.
- Inkubatorte vid rumstemperatur (ljus inte nödvändigt) i 3-5 dagar tills mycket små kolonier visas (Figur 3). Det kommer att finnas två typer av fenotyper bland kolonierna. De NIT-kolonierna kommer att få glesare hyfer än NIT + kolonierna. Cirrhi från rekombinant perithecia visar både koloni fenotyper i ungefär lika proportioner. Kassera plattorna med kolonier av en enda fenotyp på dem. Notera att ibland mer än två fenotyper resultera på grund av segregering av andra faktorer.
- Flytta kolonier till V8 eller morot agar för lagring. Test kolonier på Czapeks Dox Agar (NIT-stammar kommer inte att växa på Czapeks Dox) och på handdator med Klorat (0,5 M kaliumklorat, NIT + stammarna växer inte på handdator med Klorat) för att bekräfta rätt fenotypen. Undersök dessa kolonier för de önskade egenskaper.
4. Representativa resultat
Framställning perithecia
Målet är att få en matta avperithecia utan mycel eller sporer uppenbara. Ytan på kultur kommer likna svart sammet (figur 1). Vid 24 h efter appliceringen av Tween ytan av ägarn bör ha en liten glans. Om mycel igen, då plattan inte kan ha skrapats tillräckligt för att framkalla perithecium utveckling.
Ascospore utsläpp
Alltid har angett i din analys flera block av agar från vildtypstammen. Om de inte gör eld, sedan antingen dina perithecia är för ung eller för gammal. Om de är för gamla, då många hyfer visas över ytan av kulturen ge den en vitaktig nyans. Om så inte är fallet kan de vara för ung, och analysen bör prövas på nytt i 24 timmar. Ibland Släpp kulturerna inte bra, och försöket kommer att upprepas. Var säker på att du utför testet under lämpliga ljusförhållanden.
Rekombinant avkomma
Figur 1. Stages of perithecium utveckling morot agar. Vänster, 72 h efter applicering av Tween. Notera rött pigment och mycket unga perithecia synlig som en svart korn på ytan. Rätten att, vid 144 h, har mogna perithecia bildats. Notera nästan total avsaknad av ytligt mycel i båda kulturerna.
Figur 2. Urladdning analys. Den orange moroten agar kontakten är så orienterad that-sporer med tvång uttöms från det mogna perithecia på sin yta kan ackumuleras på ytan av glasskivan. 15 h ackumulering tid.
Figur 3. Skillnader i tillväxt mellan Nit + och NIT-kolonier på selektivt mMTS medium. Denna NIT-kolonier (pilspetsar) är mindre. De NIT + kolonierna (pilar) visar stark tillväxt. Fotografera taget efter 7 dagar.
Discussion
F. graminearum är särskilt väl anpassad till studiet av fruktkroppen utveckling på grund av tillgången till en väl kommenterad genomet ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , 4), och tillgång till en Affymetrix- baserat mikromatris 6. Detta har underlättat möjligheten att identifiera gener som är viktiga för ascospore urladdning 7,11,3. De metoder som presenteras här gör det möjligt för forskare att fokusera på en diskret uppsättning utvecklingsstadier och funktioner för genetisk analys av fruktkroppar av F. graminearum. Metoderna är också lätt anpassas till relaterade svampar som kan induceras att frukten i odling, och kan användas som en standard för utveckling i en mångfald andra fungala typer fruktkropp.
Förmågan att bedöma ett spor bränning fenotyp kan vara subtil i arter där sporer är små och svåra att se, till exempel
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Science Foundation (MCB-0.923.794 FT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
References
- Bowden, R. L., Leslie, J. F. Sexual recombination in Gibberella zeae. Phytopathology. 89, 182-188 (1999).
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
