Summary
Kirurgiskt trauma inducerar en inflammatorisk reaktion. Cytokiner och endogena ligander är kända för att modulera myokardinfarktstorlek efter ischemi och reperfusion. Vi presenterar en modifierad sluten kista modell av murin ischemi och reperfusion med hängande vikter för att minimera effekterna av torakotomi.
Abstract
Kirurgiskt trauma genom torakotomi i öppna bröstkorgen modeller av koronar ligering inducerar ett immunsvar som modifierar olika mekanismer som är involverade i ischemi och reperfusion. Immunsvar ingår cytokinuttryck och frisättning eller utsöndring av endogena ligander av medfödda immunförsvaret receptorer. Aktivering av medfödd immunitet kan potentiellt modulera infarktstorlek. Vi har ändrat en befintlig mus sluten bröstet modell med hängande vikter som kan vara användbara för att studera hjärtinfarkt pre-och postconditioning och den roll som medfödda immuniteten i myokardischemi och reperfusion. Denna modell tillåter djuren att återhämta sig från kirurgiskt trauma före debuten av myokardischemi.
Flyktiga anestetika har intensivt studerat och deras förbehandling verkan för ischemisk hjärtsjukdom är väl känd. Emellertid utesluter denna skyddande effekt dess användning i öppna bröstkorgen modeller av kransartärligering. Sålunda kunde en annan fördel vara användningen av: ee väl kontrollerbara flyktiga anestetika för instrumentering i en kronisk sluten bröstet modellen, eftersom deras förkonditionering Effekten varar upp till 72 timmar. Kronisk hjärt-kärlsjukdomar med intermittent ischemi och flera olika modeller hit är andra möjliga tillämpningar av denna modell.
För den kroniska slutna bröstet modell intuberade och ventileras möss genomgå en lateral trubbigt torakotomi via den 4: e interkostalrummet. Efter identifiering av den vänstra främre nedåtgående en ligatur ledes under fartyget och båda ändarna sutur är gängade genom en tillslutning. Därefter båda ändarna sutur passerar genom bröstväggen, knyts för att bilda en slinga och lämnades i den subkutana vävnaden. Efter bröstet stängning och återhämtning för 5 dagar, möss sövs igen, bröstet huden igen och hängande vikter ansluten till slingan i EKG kontroll.
Vid slutet av ischemi / reperfusion protokollet kan hjärtan färgas med TTC för infarktStorleken bedömning eller genomgår perfusion fixering att morfometriska studier utöver histologi och immunohistokemi.
Protocol
1. Induktion av anestesi
- För induktion med isofluran, placera musen till en induktion låda, som är ansluten till den ånga satt till 3,0 vol% och syreflöde av 0,5 L / min.
- Efter medvetslöshet uppnås med taktil stimulans inte att inducera ett svar och frambenet eller bakbenet pedal tillbakadragande reflexen vara frånvarande, placera musen på en temperatur-kontrollerad operationsbordet i ryggläge. Upprätthålla anestesi under en nasal kon som är ansluten till ånga via induktion lådan. Luta huvudet genom att fastställa de övre framtänderna med en 5-0 nylonsutur att underlätta intubering.
- Sätt den rektala temperaturen sonden för att bibehålla temperaturen kroppen kärnan vid 37 ° C. Fäst extremiteterna med tejp. Korsa nedre vänstra benet över det högra benet att öppna vänstra bröstet och exponera hjärtat bättre.
- Applicera hårborttagningskräm till halsen och vänster bröst. Torka av krämen efter 1 minut. Applicera povidon-jod för lokal huddesinfektion. Injicera buprenorfin 0,05 mg / kg kroppsvikt för smärtlindring subkutant.
- Göra en mittlinjesincision nackskinn med en liten sax. Trubba dissekera de körtlar och muskler som täcker luftstrupen. Slå på fläkten. Ventilator inställningar ska anpassas till fysiologiska parametrar. Vi använder en Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Harvard Apparatus med en andningsfrekvens av 105/min och en tidalvolym på 200 pl. Dra tungan med en tång och försiktigt in en 22 G metallrör. Bekräfta intubering genom direkt visualisering av röret inuti luftstrupen och bröstet rörelse.
- Bypass induktion rutan genom att byta till avgas slang för att förhindra kontaminering av laboratorielokaler. Justera ånga till 2,0 vol%.
2. Torakotomi
- Göra en hudincision i den vänstra medioklavikularlinjen. Trubba dissekera den subkutana vävnaden mot armhålan. Identifiera gränsen av de stora pectoralis muskler och trubbig dissekera den från mindre pectoralis muskel under. Dra den mindre pectoralis muskler till höger. Du kommer att få en direkt bild av bröstkorgen.
- Identifiera och rakt på sak pentetrate 4th interkostalrummet med en pincett. Låt spetsarna på pincetten spänner över interkostala utrymme att tillåta dig själv att sätta in upprullningsdon som justeras med gummiband fästa operationsbordet. Du bör ha en tydlig bild av hjärtat, inklusive vänstra ytterörat. Denna tillgång är vanligtvis uppnås utan blodförlust och därmed utan behov av elektriska koagulation.
3. Beredning av Heart
- Dra försiktigt bort hjärtsäcken utan att skada hjärtat.
- Identifiera den vänstra nedåtgående främre artären (LAD) genom att lyfta bort den vänstra atriala öronmusslan från den främre väggen av den vänstra ventrikeln. LAD kommer att ses bara under en kort rak kurs med suddiga gränser och klarröd färg jämfört med venerna.
4. KranskärlInstrumentering
- Framställa en 8-0 prolen sutur med en avsmalnande nålspetsen genom att bilda den till en U-form. Passera nålen genom hjärtmuskeln djupt nog under LAD.
- Avbröt nåländen av suturen för att ha 1 cm av sutur vid varje sida.
- Klipp av en 1 mm PE-10 slangsektionen som en klämmande hindrar vassa hörn. Låt tillslutningen att suga i alkoholhaltiga drycker desinfektion och peka ut före användning Anm.: Slangen ska blötläggning i 100% etanol i 24 timmar för att sterilisera det på lämpligt sätt 4.
- Ämne både sutur upphör på grund tillslutningen.
- Använd en storlek 3 nål Kalt sutur att vägleda både sutur ändarna i den övre interkostalrummet.
5. Chest Stängning
- Binda den övre och nedre ribba av den öppnade interkostala utrymmet tillsammans med en 6-0 prolen sutur. Innan du stänger bröstet du ska gå till 5,2.
- Hyperinflate lungorna under några andningscykler att öppnaupp atelektas genom att klämma den expiratoriska röret. Denna manöver kan också bero på vilken typ av fläkten du använder. Ställ in tidalvolymen till 300 ul tills bröstet är stängd.
- Ställa ventilen tidalvolym tillbaka till 200 | il.
- Binda båda ändarna av 8-0 LAD-ligering sutur för att få dem bilda en slinga.
- Bifoga ett EKG.
- Haka upp vikterna till 8-0 slingan och låt vikterna försiktigt hänga. Du bör se en betydande ST-höjning inom några hjärtslag. Släpp vikter Anm.: Dessa experiment med totalt 5,5 g vikt, men vikten kan variera beroende på stam och kroppsvikt hos möss.
- Placera öglan i en subkutan ficka och stänga huden med 6-0 enda knut suturer.
- Låt musen återhämta sig efter extubering under en värmande lampa.
6. Myokardiell ischemi och reperfusion
- Efter en återhämtningsperiod på åtminstone 5 dagar inducera anestesi med en blandning av ketamin, xylazinoch atropin (4 ml / kg kroppsvikt, ketamin 10 mg / ml, xylazin 2 mg / ml, atropin 0,06 mg / ml, 1.
- Intuberas och ventilera med rumsluft för ischemi och reperfusion experiment.
- Öppna sutureras huden i bröstet. Förbered 8-0 sutur slingan. Bifoga ett EKG.
- Haka upp vikterna och låt dem hänga. Följ din ischemi protokollet. Se EKG för potentiell upplösning av ST-höjning 2.
- Släpp vikterna i slutet av ischemi. Stäng huden extubera musen och låt den återhämta sig.
7. Infarktstorlek Bedömning med reperfusion tid upp till 3 dagar
- Bedöva och intuberas musen i slutet av önskad reperfusion tid.
- Skär bröstet huden i mittlinjen till xyphoid. Öppna buken och skära membranet under bröstkorgen. Skära bröstet öppen på båda sidor om medioklavikularlinjen.
- Fäst flaxade främre bröstkorgen med en sutur för att få fri tillgång till hjärtat.
- Försiktigt förbereda 8-0 sutur slingan. Skär slingan och knyt en knut för att täppa till LAD.
- Injicera 10% ftaloblått i vänster förmak. För att förhindra hjärt-volymöverbelastning, injicera färga långsamt och aspirera från tid till annan.
- Injicera kaliumklorid i vänster förmak. Detta kommer att stoppa hjärtat i diastole för lika infarktstorlek bedömning.
- Klipp ut hjärtat och lämnar så mycket av extracardial vävnad som möjligt för att underlätta skära hjärtat.
- Tvätta hjärtat i fosfatbuffertlösning.
- Frysa hjärtat i isopentan och flytande kväve. Alternativt kan hjärtan placeras i en frys tills lätt frusen.
- Skär hjärtat i 1 mm skivor. Vi har en skivanordning tillverkad av rakblad för att skära hjärtat i lika segment (fig 4). Se till hjärtat är korrekt inriktat för att skära vinkelrätt mot den långa axeln hos hjärtat.
- Inkubera skivorna i 1,5% TTC vid 37 ° C under 20 minuter. Vi använder en 96 brunnars platta därvarje skiva placeras i en brunn. Detta kommer att spara TTC och bespara er användning av ett Whatman filter för att förhindra artefakter.
- Fäst skivorna med 4% formaldehyd natten. Detta kommer att krympa på skivorna, men förbättrar kontrasten av färgämnet.
- Sätt skiva på ett objektglas. Täck med en annan bild. Använd 1 distanser mm Metall i vardera änden av objektglaset och hålla glasen tillsammans med gem.
- Ta en digital bild från båda sidor av varje skiva. Använd alltid samma inställningar och inte zooma in för mindre skivor.
- Använd en programvara för planimetri. Vi använder ImageJ av NIH. Använd alltid samma kriterier för infarcerade områden, t.ex. endast vita områden infarkt. Vita rosa områden är inte infarkt. Vi har förblindat utredare för interventioner och planimetri också.
8. Alternativ Heart Förberedelse för histologi
- Följ steg 7.1 till 7,2. och fortsätt till 8,2. Pålitlig infarkt bedömning TTC färgning kan göras inom 72 timmars reperfusion på grund av ärr krympning.
- Förbered bort eventuellt extracardial vävnad och slö dissekera tymus täcker aortaroten.
- Ta aorta ascendens med pincett och skär ut hjärtat med som mindre extracardiac vävnad som möjligt.
- Tvätta och pressa hjärtat försiktigt i kardioplegiska lösning.
- Placera hjärtat i en p35 skål fylld med kardioplegisk lösning.
- Förbered aorta ascendens.
- Kanylera aortaascendens med en kanyl som är förfylld med formaldehyd. Vi använder zink-formalin fixativ och en 24 G IV-ledningen 3.
- Skär ut ett hål mellan vänster öronmusslan och vänster förmak.
- Sätt en 26 G kateter i vänster atrium med en 16 cm lång slang som är fäst till den. Du kan också använda en PE50 rör.
- Perfundera hjärtat under tio minuter med formalin fixativ.
- Placera kärnan till ett rör fyllt med fixativ för maximalt 24 timmar vid 7 ° C.
- Fortsätt med prepdelser för histologi / immunohistokemi.
9. Representativa resultat
Kronisk kransartärligering är en komplex teknik med flera fallgropar. Men när det behärskar den kan utföras med mycket låga dödligheten och mycket tillförlitliga resultat. Optimal positionering av mössen och tillgång till hjärtat är avgörande för framgångsrik identifiering och instrumentering av LAD. Positionen för ligering kommer naturligtvis att påverka infarktstorlek, vilket således kräver att ha en standardiserad ligeringsstället. Dessutom, om septala branscher berörs det kan leda till en grenblock i stället för ST-höjning. Blödning från epimyocardial vener eller från ventrikeln, om ligering är för djup, kan förekomma och möss bör uteslutas om blödningen är kraftig. Pericard bör tas bort så fullständigt som möjligt. Lämnar pericard kommer att förvärra trycka in nålen i myocard för ligering. Dessutom kommer det att orsaka perikardit, så småningominducerar sammanväxningar och kommer att göra histologisk undersökning svårt. PE-tillslutning bör vara så kort som möjligt utan några skarpa hörn för att minimera trauma myocard. Hyperinflation i lungorna är helt avgörande för att förhindra spänningar pneumothorax efter bröstet stängning. Det finns inget behov av en bröstkorgsdränage. Testning av ett korrekt läge av ligeringen i det öppna bröstkorgen genom att dra suturen ändarna bör utelämnas eftersom dragspänningen är svår att kontrollera. Om instrumentering av LAD misslyckas, måste ytterligare försök undvikas eftersom detta kommer att lägga trauma och ödem till myokardiet.
För att uppnå tillförlitliga resultat, bör protokollparametrar standardiseras. Därför möss intuberades och ventileras med rumsluft och kroppstemperatur är tätt kontrolleras med ett återkopplingssystem. Användningen av hängande vikter har redan betonats. Andra drar anordningar har nackdelen av spänning förluster och icke-standardiserade dra spänning. Ischemiskpre-och postconditioning protokoll med flera cykler av reperfusion och ocklusion lättare utförs med hängande vikter eftersom de bara behöver lyftas och låt hängde (figur 1).
Infarkt områden (vit) bör skiljas från områden med risk (röd) och icke-området på risker (blå) (Figur 2A-B). Infarkt storlekar är beroende av längden av ischemi. Reperfusion tid bör vara minst 2 timmar för att tillåta framgångsrik TTC färgning (figur 1 och 2). Viktigast av allt är cytokin-RNA-expression låg skenopererade djur som hade alla kirurgiska procedurer förutom ischemi och reperfusion i jämförelse med djur som genomgick hjärtinfarkt (Figur 3A-C).
Figur 1. Infarktstorleken i procent av riskområdet (IS / AAR%). Möss genomgick 30 minuter ischemi följt av 120 minuter efter reperfusion (l / R, n = 10). IPC: Ischemisk postconditioning genomgick möss 30 minuter av ischemi följt av 3 cykler av reperfusion / ocklusion 20 sek vardera (n = 6, * indikerar p <0,05).
Figur 2A. Representant TTC-färgade hjärtat skiva. Vit: infarkt område, Röd: riskområdet, Blå: icke-ockluderade området.
Figur 2B. Representant skiva en infarktområdet (vit) område. Observera att på grund av den koniska formen av vänster kammare nära spetsen, kommer epimyocard visas som plana ytan och bör inte övervägas för planimetrisk mätning (rosa / blå yttre delen). Röd = TTC färgas lönsamt myocard.
Figur 3A. Ingen signifikant skillnad i minocardial TNF-α mRNA-expression efter 30 minuter ischemi och 120 minuter reperfusion. n = 4-6 per grupp.
Figur 3B. Myocardial IL-1β mRNA-expression efter 30 minuter ischemi och 120 minuter reperfusion (l / R). Det finns ingen signifikant skillnad mellan kontroll (ingen operation) och skenopererade (ingen ischemi / reperfusion)-grupp. n = 4-6 per grupp, anger p <0,05.
Figur 3C. Myocardial IL-6-mRNA-expression efter 30 minuter ischemi och 120 minuter reperfusion (l / R). Det finns ingen signifikant skillnad mellan kontroll (ingen operation) och skenopererade (ingen ischemi / reperfusion)-grupp. n = 4-6 per grupp, anger p <0,05.
Figur 4A-C. HearT skär enhet. A: avslutades med rakblad i skärläge. B: öppen från sidan. C: öppen, framifrån. Hjärtat kommer att anpassas i spåret av den vita plasten bädden med den långa axeln vinkelrät till rakblad (pil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har ändrat en murin sluten bröstet modellen genom att gå till hjärtat genom en vänster lateral interkostala torakotomi och leder ut LAD suturer till bröstet i vänster medioklavikularlinjen. Lämnar beniga bröstkorgen intakt minimerar trauma, behov av smärtstillande, kirurgiska infektioner och därmed underlätta återvinningen. Genom att bevara den vänstra inre däggdjuret artären finns det inget behov för elektrokauterisation. Vi lämnar suturen slingan i den subkutana vävnaden för senare enkel åtkomst och använda en hängande vikt för en definierad ocklusion. En sluten bröstet modellen tillåter tillämpningen av alla undersökningsprotokoll av myokardischemi och reperfusion med avseende på kirurgiskt trauma och efterföljande immunsvar 4. Dock cytokin RNA uttrycket ökat för upp till 3 dagar på grund av kirurgiskt trauma hos möss, råttor och hundar 4-6. Sålunda bör en återhämtning intervall av 5 dagar följas. Dessutom möjliggör denna modell användning av flyktiga Anesthetics för instrumentering som har en känd förkonditionering effekt för upp till 72 timmar 7,8. opioider för postoperativ smärta kan också lindra hjärtinfarkt. Det har visats för buprenorfin som myokardial funktion förbättras efter global ischemi 9. Men mössen normalt inte behöver ytterligare doser av buprenorfin som bedöms av beteende observation. Det finns bevis för att kirurgiskt trauma föregår hjärtinfarkt kommer att orsaka en "bakgrund" brus cytokinuttryck och dessutom modulera infarktstorlek. Ren et al. har visat att avlägsna kirurgiskt trauma framkallar förkonditionering i hjärtat 10. Andra endogena ligander, såsom hög mobilitet grupp låda 1 (HMGB1) eller värmechockproteiner som frigörs eller utsöndras efter trauma har visat sig modulera myokardial funktion 11-13.
Hjärtinfarkt i prehospital miljö sker oftast utan preceDing trauma eller skada. Således kan en kronisk sluten bröstet modellen en mer levande förhållningssätt till myokardischemi och reperfusion.
Potentiella undersökningsprotokoll inkluderar ischemiska och farmakologiska före och postconditioning och invasiva hemodynamiska mätningar. Framtida tillämpningar av denna modell skulle kunna innehålla flera drabbade modeller utan att behöva överväga kirurgiskt trauma instrumentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Daniel Duerr för hans råd om perfusion-fixering teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vapor | Drägerwerk AG | Isoflo | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Light source | Schott | KL 1500 LCD | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| MiniVent Type 845 | Hugo Sachs Elektronik | ||
| 8-0 Prolene | Ethicon | BV130-5 6.5mm 3/8c | |
| 6-0 Prolene | Ethicon | BV-1 9.3 mm 3/8c | |
| Kalt suture needle size 3 | FST | 12050-03 | |
| Triphenyltetrazolium | Sigma Aldrich | 93145 | |
| Phthalo blue | Heucotech LTD | ||
| PowerLab |  ADInstruments |
References
- Lim, S. Y., Davidson, S. M., Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: the essential role of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc. Res. 75, 530-535 (2007).
- Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (50), e2526 (2011).
- Michael, L. H. Myocardial infarction and remodeling in mice: effect of reperfusion. Am. J. Physiol. 277, H660-H668 (1999).
- Nossuli, T. O. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies 52. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, H1049-H1055 (2000).
- Irwin, M. W. Tissue expression and immunolocalization of tumor necrosis factor-alpha in postinfarction dysfunctional myocardium 846. Circulation. 99, 1492-1498 (1999).
- Michael, L. H. Creatine kinase and phosphorylase in cardiac lymph: coronary occlusion and reperfusion. Am. J. Physiol. 248, 350-359 (1985).
- Tonkovic-Capin, M. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels 765. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283, H61-H68 (2002).
- Tsutsumi, Y. M. Role of caveolin-3 and glucose transporter-4 in isoflurane-induced delayed cardiac protection. Anesthesiology. 112, 1136-1145 (2010).
- Benedict, P. E., Benedict, M. B., Su, T. P., Bolling, S. F. Opiate drugs and delta-receptor-mediated myocardial protection. Circulation. 100, II357-II360 (1999).
- Ren, X., Wang, Y., Jones, W. K. TNF-alpha is required for late ischemic preconditioning but not for remote preconditioning of trauma. J. Surg. Res. 121, 120-129 (2004).
- Andrassy, M. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart. Circulation. 117, 3216-3226 (2008).
- Kim, S. C. Extracellular heat shock protein 60, cardiac myocytes, and apoptosis. Circ. Res. 105, 1186-1195 (2009).
- Lin, L. HSP60 in heart failure: abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 293, 2238-2247 (2007).
