Et murint lukket bryst Model for myocardial iskæmi og reperfusion

Summary

Kirurgisk trauma inducerer en inflammatorisk respons. Cytokiner og endogene ligander vides at modulere myocardial infarktstørrelse efter iskæmi og reperfusion. Vi præsenterer en modificeret lukket bryst model af murint iskæmi og reperfusion under anvendelse hængende vægt på at minimere virkningerne af torakotomi.

Abstract

Kirurgisk trauma af thorakotomi med åbne bryst modeller af koronar ligatur inducerer en immunrespons, som modificerer forskellige mekanismer involveret i iskæmi og reperfusion. Immunrespons omfatter cytokinekspression og frigivelse eller sekretion af endogene ligander af medfødte immunforsvar receptorer. Aktivering af medfødte immunitet kan potentielt modulere infarktstørrelse. Vi har ændret en eksisterende murine lukket kiste model ved hjælp af hængende vægte, som kunne være nyttige for at studere myokardie præ-og postconditioning og den rolle medfødte immunitet i myokardie iskæmi og reperfusion. Denne model tillader dyrene at komme sig kirurgisk traume, før indtræden af ​​myocardial iskæmi.

Flygtige anæstetika er intenst undersøgt, og deres forkonditionering virkning for iskæmisk hjertesygdom, er velkendt. Men denne beskyttende virkning udelukker dens anvendelse i åbne bryst modeller af kranspulsåreombinding. Således kunne en anden fordel være anvendelsen af ​​the godt kontrollerbare flygtige anæstetika til instrumentering i en kronisk lukket brystet model, idet deres klargøring, effekten varer op til 72 timer. Kroniske hjertesygdomme med intermitterende iskæmi og flere ramte modeller er andre mulige anvendelser af denne model.

Den kroniske lukkede bryst model undergår intuberet og ventileret mus en lateral stump torakotomi via 4. intercostale rum. Efter identifikation af den venstre forreste nedadgående en ligatur føres under fartøjet, og begge sutur ender er ført gennem en okkluder. Derefter er begge sutur ender føres gennem brystvæggen, knyttet til dannelse af en løkke, og efterladt i det subkutane væv. Efter brystet lukning og genopretning i 5 dage, er mus bedøves igen, brystet hud og genåbnet hængende vægte hooked op til loop under EKG-kontrol.

Ved slutningen af ​​iskæmi / reperfusion protokollen, kan hjerter farves med TTC for infarktStørrelsen vurdering eller underkastes perfusion fiksering for at tillade morfometriske undersøgelser foruden histologi og immunhistokemi.

Protocol

1. Induktion af anæstesi

1. Til induktion med isofluran, anbringes musen i en induktion kasse, der er forbundet med damp sættet 3,0 vol% og oxygenstrøm på 0,5 L / min.
2. Efter bevidstløshed opnås med taktil stimulering ikke at inducere et respons, og forlem eller bagben pedal tilbagetrækning refleks er fraværende, anbringe musen på et temperaturstyret operationsbord i rygleje. Opretholde anæstesi i en nasal kegle, som er forbundet med damp via induktion boksen. Læne hovedet ved at fastsætte de øverste fortænder med en 5-0 nylon sutur for at lette intubation.
3. Indsætte rektal temperatursonde at opretholde kropstemperatur ved 37 ° C. Fastgør enderne med tape. Kryds nederste venstre ben over det højre ben for at åbne op for venstre bryst og eksponere hjertet bedre.
4. Påfør hårfjerningsmiddel til halsen og venstre bryst. Tør cremen efter 1 minut. Anvend povidon-jod til lokal huddesinfektion. Injicer buprenorphin 0,05 mg / kg legemsvægt til smertelindring subkutant.
5. Lav en midtlinie hals incision i huden med en lille saks. Blunt dissekere de kirtler og muskler, der dækker luftrøret. Tænd for ventilatoren. Ventilator indstillinger skal tilpasses fysiologiske parametre. Vi anvender en Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Harvard Apparatus med en respirationsfrekvens på 105/min og et respirationsvolumen på 200 ul. Træk tungen med en pincet og indsæt forsigtigt en 22 G metalrør. Bekræfte intubation ved direkte visualisering af røret inde i luftrøret og brystet bevægelse.
6. Bypass induktion kassen ved at skifte til spilde gas slangen for at forhindre forurening af laboratoriefaciliteter. Justere damp til 2,0 vol-%.

2. Torakotomi

1. Foretag en incision i huden i den venstre midclavicular linje. Sløve dissekere det subkutane væv mod armhulen. Identificer grænsen af ​​de store pectoralis muskler og sløve dissekere det fra mindre pectoralis muskel nedenunder. Træk den mindreårige pectoralis muskel til højre. Du vil få en direkte udsigt over brystkassen.
2. Identificer og ligeud pentetrate 4. interkostale plads med en pincet. Lad spidsen af ​​tangen spænde interkostale plads til at tillade dig selv at indsætte retraktorerne, som reguleres med elastikker fastgjort til operationsbordet. Du skal have et klart billede af hjertet, herunder venstre øret. Denne adgang opnås sædvanligvis uden blodtab og således uden behovet for elektrisk koagulation.

3. Forberedelse af Heart

1. Træk forsigtigt hjertesækken uden at skade hjertet.
2. Identificere den venstre forreste nedadgående arterie (LAD) ved at løfte fra venstre atrielle øremuslingen fra den forreste væg af den venstre ventrikel. LAD kun kan ses over en kort lige bane med flydende grænser og klar rød farve i forhold til de vener.

4. KoronararterieInstrumentering

1. Fremstilling af en 8-0 prolene sutur med en tilspidset nål spids ved formning af den til en U-form. Før nålen gennem myokardiet dybt nok under LAD.
2. Afskåret nåleenden af ​​suturen have 1 cm sutur på hver side.
3. Skær en 1 mm PE-10 slangeafsnit som en okkluder forhindrer nogen skarpe hjørner. Tillade okkluderingsaggregatet i blød i alkoholisk desinfektion og tryk, før brug. Bemærk: Røret bør gennemvædning i 100% ethanol i 24 timer for at sterilisere den passende ^4.
4. Gevind både sutur ender gennem okkluderen.
5. Anvende en størrelse 3 Kalt suturnål at styre både sutur ender af den øvre intercostale rum.

5. Bryst Lukning

1. Binde den øvre og nedre ribbe af den åbnede interkostale rum sammen med en 6-0 prolene sutur. Før du lukker brystet skal du fortsætte til 5,2.
2. Hyperinflate lungerne i nogle respiratoriske cyklus for at åbneop atelektase ved at spænde expiratory røret. Dette spillerum kan også afhænge af typen af ​​ventilatoren bruge. Indstil tidal volumen til 300 gl, indtil brystet er lukket.
3. Indstille ventilatoren tidal volumen tilbage til 200 pi.
4. Binde begge ender af 8-0 LAD underbinding sutur, at de danner en løkke.
5. Vedhæft et EKG.
6. Tilslut vægtene til 8-0 loop og lad vægtene omhyggeligt hænge. Du bør se en signifikant ST-elevation i løbet af få hjerteslag. Slip vægte. Bemærk: Disse eksperimenter anvende i alt 5,5 g vægt, men vægt kunne variere baseret på stamme og legemsvægten af mus.
7. Placere løkke i en subkutan lomme og lukke huden med 6-0 enkelt knude suturer.
8. Lad mus restituere efter ekstubation under en opvarmning lampe.

6. Myocardial iskæmi og reperfusion

1. Efter en restitutionsperiode på mindst 5 dage inducere anæstesi med en blanding af ketamin, xylazinog atropin (4 ml / kg legemsvægt, ketamin 10 mg / ml, xylazin 2 mg / ml, atropin 0,06 mg / ml, ^1.
2. Intubere og ventilere med rumluft for iskæmi og reperfusion eksperimenter.
3. Åbne sutureres huden af ​​brystet. Forbered 8-0 sutur loop. Vedhæft et EKG.
4. Tilslut vægtene og lad dem hænge. Følg din iskæmi protokol. Se EKG for potentiel opløsning af ST-elevation ^2.
5. Frigiver vægte ved udgangen af ​​iskæmi. Luk huden, extubate musen, og lad det komme.

7. Infarktstørrelsen vurdering med Reperfusion Tiden op til 3 dage

1. Bedøve og intubere mus ved afslutningen af ​​det ønskede reperfusion tid.
2. Skær brystet huden i midterlinjen til xyphoid. Åbn maven og skære membranen under brystkassen. Skær brystet på begge sider af midclavicular linje.
3. Fastgør slog forreste brystvæg med en sutur for at få uhindret adgang til hjertet.
4. Omhyggeligt fremstille 8-0 suturen sløjfen. Skær loop og bind en knude for at okkludere LAD.
5. Injicer 10% phthaloblå ind i venstre atrium. For at forhindre hjerte volumeoverbelastning, injicere farve langsomt og opsug fra tid til anden.
6. Injicere kaliumchlorid i venstre atrium. Dette vil standse hjertet i diastolen for lige infarktstørrelsen vurdering.
7. Udskæres hjertet, der forlader så meget extracardial væv som muligt for at lette skæring af hjertet.
8. Vask hjertet i phosphatpuffer-opløsning.
9. Fryse hjertet i isopentan og flydende nitrogen. Alternativt kan hjerter anbringes i en fryser indtil let frosset.
10. Skær hjertet i 1 mm skiver. Vi har en udskæring anordning fremstillet af barberblade at skære hjertet i lige skiver (fig. 4). Sørge hjertet er korrekt justeret til at skære vinkelret på den lange akse af hjertet.
11. Inkubér skiverne i 1,5% TTC ved 37 ° C i 20 min. Vi anvender en 96-brønds plade, hvorhver skive anbringes i en brønd. Dette vil spare TTC og spare dig brugen af ​​en Whatman filter for at undgå artefakter.
12. Fastgør skiver med 4% formaldehyd natten. Dette vil krympe skiverne, men øger kontrasten af ​​farvestoffet.
13. Sæt skiven på et objektglas. Dæk med et andet dias. Brug 1 mm metalafstandsstykker i hver ende af slæden og holde de glider sammen med papirclips.
14. Tage et digitalt billede fra begge sider af hver skive. Brug altid de samme indstillinger og ikke zoome ind for mindre skiver.
15. Brug en software til planimetri. Vi anvender ImageJ af NIH. Brug altid de samme kriterier for infarkt områder, der fx kun hvide områder infarkt. Hvide rosa områder ikke infarkt. Vi har blindet efterforskere til interventioner og planimetri så godt.

8. Alternativ Heart Forberedelse til Histologi

1. Følg trin 7.1 til 7,2. og videre til 8,2. Pålidelig infarkt vurdering med TTC-farvning kan ske inden for 72 timer af reperfusion på grund af ar krympning.
2. Forbered rabat på alle extracardial væv og sløve dissekere thymus dækker aorta roden.
3. Tag opstigende aorta med pincet og klip hjertet med som mindre ekstrakardiale væv som muligt.
4. Vask og klemme hjertet blidt i kardioplegisk løsning.
5. Placer hjertet til en p35 fad fyldt med kardioplegisk løsning.
6. Forberede aorta ascendens.
7. Kanyle i aorta ascendens med en kanyle, der er forfyldt med formaldehyd. Vi bruger zink-formalin fiksativ og en 24 G iv linje ^3.
8. Skær et hul mellem venstre forkammer og venstre atrium.
9. Indsætte en 26 G kateter ind i venstre atrium med en 16 cm lang slange fastgjort til den. Du kan også bruge en PE50 rør.
10. Perfundere hjertet i ti minutter med formalin fiksativ.
11. Placere hjertet i et rør fyldt med fikseringsmiddel i maksimalt 24 timer ved 7 ° C.
12. Fortsæt med preparation til histologi / immunohistokemi.

9. Repræsentative resultater

Kronisk kranspulsåreombinding er en kompliceret teknik med flere faldgruber. Imidlertid, når det er styr på det kan udføres med meget lav dødelighed og meget pålidelige resultater. Optimal placering af mus og adgang til hjertet er afgørende for en vellykket identifikation og instrumentering af LAD. Positionen af ​​ligeringen vil naturligvis påvirke infarktstørrelse, hvilket således kræver at have en standardiseret ligeringsstedet. Også, hvis septale grene påvirkes dette kunne føre til en grenblok stedet for ST-elevation. Blødning fra epimyocardial vener eller ventrikel, hvis underbinding er for dybt, kan forekomme og mus bør udelukkes, hvis blødningen er overdreven. Pericard bør fjernes så fuldstændigt som muligt. Forlader pericard vil forværre skubbe nålen ind i myocard til ligering. Det vil også forårsage pericarditis, eventueltinducerer adhæsioner og vil gøre histologisk undersøgelse vanskelig. PE-okkluderingskroppen bør være så kort som muligt, uden nogen skarpe hjørner for at minimere traume myocard. Hyperinflation af lungerne er helt afgørende at undgå spændinger pneumothorax efter brystet lukning. Der er ikke behov for en kiste dræning. Afprøvning af et korrekt position af ligering i den åbne brystet ved at trække suturen enderne skal udelades, fordi trække spænding er vanskelig at styre. Hvis instrumentering af LAD mislykkes, bør yderligere forsøg undgås, da dette vil tilføre traume og ødem til myokardiet.

For at opnå pålidelige resultater, bør protokolparametre standardiseres. Derfor mus intuberet og ventileret med stueluft og legemstemperatur er stramt kontrolleret med et feedback-system. Anvendelse af hængende vægt allerede er blevet understreget. Andre trækker indretninger har den ulempe spænding tab og ikke-standardiserede trække spænding. Iskæmiskpræ-og postconditioning protokoller med flere cyklusser af reperfusion og okklusion er lettere udføres med hængende vægte, fordi de bare skal løftes og lad hængt (figur 1).

Infarkt områder (hvid) bør kunne skelnes fra truede områder (rød) og ikke området på risici (blå) (Figur 2A-B). Infarkt størrelser er afhængige af varigheden af ​​iskæmi. Reperfusion tid skal være mindst 2 timer for at tillade en vellykket TTC-farvning (fig. 1 og 2). Vigtigst cytokin RNA-ekspression er lav i skinopererede dyr, der havde alle kirurgiske procedurer bortset iskæmi og reperfusion sammenlignet med dyr, som har undergået myokardieinfarkt (figur 3A-C).

Figur 1. Infarktstørrelse i procent af området med risiko (IS / AAR%). Mus gennemgik 30 minutter iskæmi efterfulgt af 120 minutters reperfusion (I / R, n = 10). IPC: Iskæmisk postconditioning, mus undergik 30 minutters iskæmi efterfulgt af 3 cyklusser af reperfusion / okklusion 20 sek hver (n = 6, * angiver p <0,05).

Figur 2A. Repræsentant TTC-farvede hjerte skive. Hvid: infarktareal, Red: område i fare, Blå: ikke-tillukkede område.

Figur 2B. Repræsentant skive af en infarktramt (hvid) område. Bemærk, at på grund af den koniske form af den venstre ventrikel tæt på spidsen, vil epimyocard vist som plane område og skal ikke betragtes for planimetrisk måling (lyserød / blå ydre område). Rød = TTC farves levedygtige myocard.

Figur 3A. Ingen signifikant forskel i mitocardial TNF-α mRNA-ekspression efter 30 minutter iskæmi og 120 minutter reperfusion. n = 4-6 per gruppe.

Figur 3B. Myocardial IL-1β-mRNA-ekspression efter 30 minutter iskæmi og 120 minutter reperfusion (I / R). Der er ingen signifikant forskel mellem kontrol (ingen kirurgi) og skinopererede (ingen iskæmi / reperfusion) gruppe. n = 4-6 for hver gruppe, * angiver p <0,05.

Figur 3C. Myocardial IL-6-mRNA-ekspression efter 30 minutter iskæmi og 120 minutter reperfusion (I / R). Der er ingen signifikant forskel mellem kontrol (ingen kirurgi) og skinopererede (ingen iskæmi / reperfusion) gruppe. n = 4-6 for hver gruppe, * angiver p <0,05.

Figur 4A-C. Heart afskæringsindretningen. A: lukket med barberblade i skæreposition. B: åben, set fra siden. C: åben, set forfra. Hjerte vil blive rettet ind i rillen af ​​den hvide leje med sin lange akse vinkelret på barberblade (pil).

Discussion

Vi har ændret en murin lukket kiste model ved at gå ind i hjertet gennem en venstre lateral interkostale torakotomi og lede de LAD suturer til brystet i venstre midclavicular linje. Forlader knoklede brystkassen intakt vil minimere traumer, har brug for smertestillende medicin, kirurgiske sårinfektioner og dermed lette inddrivelsen. Ved at bevare den venstre indre pattedyret arterie der ikke er behov for elektrokauterisation. Vi forlader suturen loop i det subkutane væv til senere nem adgang og bruge en hængende vægt system til en defineret okklusion. En lukket bryst model muliggør anvendelsen af alle undersøgelsesprotokoller af myocardial iskæmi og reperfusion i forbindelse med kirurgisk trauma og efterfølgende immunrespons ^4. Imidlertid er cytokin-RNA-ekspression øges op til 3 dage på grund af kirurgisk trauma i mus, rotter og hunde ^4-6. Således bør en genvinding interval på 5 dage følges. Desuden er denne model tillader anvendelsen af ​​flygtige Anesthetics for instrumentering, som har en kendt konditioneringscyklus virkning i op til 72 timer ^7,8. opioider til postoperativ smerte kan også forbedre myokardieinfarkt. Det er blevet vist for buprenorphin at myocardial funktion forbedres efter global myocardial iskæmi ^9. Men mus, generelt ikke har brug for yderligere doser af buprenorphin som bedømt ud fra adfærdsmæssige observation. Der er beviser for, at kirurgisk traume forud myokardieinfarkt vil forårsage en "baggrund" støj for cytokinekspression og i øvrigt, modulere infarktstørrelse. Ren et al. har vist, at fjerne kirurgisk traume inducerer forbehandling af hjertet ^10. Andre endogene ligander, såsom høj mobilitet gruppe boks 1 (HMGB1) eller varmechokproteiner, som frigives eller udskilles efter trauma har vist at modulere myocardial funktion ^11-13.

Myokardieinfarkt i en præhospital omgivelser sker normalt uden preceDing traume eller skade. Således er en kronisk lukket-bryst-model giver en mere levende tilgang til myocardial iskæmi og reperfusion.

Potentielle undersøgelsesprotokoller omfatter iskæmiske og farmakologiske præ-og postconditioning og invasive hæmodynamiske målinger. Fremtidige anvendelser af denne model kunne omfatte flere hit modeller uden at skulle overveje den kirurgiske traume af instrumentering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vapor	Drägerwerk AG	Isoflo
Microscope	Leica	M80
Light source	Schott	KL 1500 LCD
Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus
MiniVent Type 845	Hugo Sachs Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6.5mm 3/8c
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 9.3 mm 3/8c
Kalt suture needle size 3	FST	12050-03
Triphenyltetrazolium	Sigma Aldrich	93145
Phthalo blue	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments