Summary
단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.
Abstract
단일 미생물 세포의 전체 게놈 증폭 및 염기 서열 재배 1-3의 필요없이 게놈 특성화 할 수 있습니다. 유비쿼터스와 우리의 행성 4에서 가장 많은 엔티티와 모든 환경 5 중요한 바이러스, 유사한 접근 방식을 통해 밝혀 질 못하고있다. 여기에서 우리는 '단일 바이러스 게놈'(SVG)라는 단일 비리의 게놈을 분리하고 특성화 방법을 설명합니다. SVG 후속 시퀀싱 반응에 사용할 수있는 고 분자량의 게놈 DNA (gDNA를)을 얻기 위해 각각의 바이러스 전체 게놈 증폭을 분리하는 유동 세포 계측법을 사용합니다.
Protocol
1. 바이러스 정학의 준비
유동 세포 계측법을 통해 단일 비리의 분리하기 전에, 고정되지 않은 바이러스 현탁액을 준비합니다.
- 반드시 최종 바이러스 현탁액을 만들기 이전에 설정된 프로토콜을 사용하여 바이러스 입자를 분리하는 것은 0.1에 포함되어 μm의 여과 TE (트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8). 다른 방법은 해당 사용 화학 응집 7 개발되어 있지만, 우리는 접근 접선 흐름 여과 (TFF)를 사용하여 6을 추천합니다.
- 예를 들어, epifluorescence에 8-10 또는 유동 세포 계측법 11,12을 사용하여 설정 프로토콜을 사용하여 바이러스 입자를 열거합니다.
- 두 에펜 도르프 튜브 (최종 부피는 1,000 μL 할 것을 권장합니다)로 나누어지는 바이러스 현탁액을.
2. 유동 세포 계측법
- 사용자 정의 포워드 분산 PMT (FSC PMT)가 장착 BD FACSAria II 흐름 cytometer에를 사용하여 바이러스를 정렬하려면, 0.1에서 바이러스 입자를 희석 TE, pH가 8 μm의 여과.0 200 이벤트 초 -1의 경우 속도에 대한 적절한 역가합니다.
- 신호 대 잡음 식량을 극대화하기 위해 임계 값, 예를 들어 설정합니다. T4 및 람다 파지 입자에게 다음을 포함하는 혼합 조립을 권장합니다 : FSC PMT를 1,000 SSC에서 200.
- 단지 1을 포함하는 "빈"샘플) 0.1 μm의 필터 TE 2) 1E-4 0.1 μm의 필터 TE와 SybrGreen1 주식의 희석 (10,000 X)의 100 μl를 실행합니다.
- 스테인드 바이러스 현탁액 (주식 1E-4 희석 SybrGreen1), 5000 사건 각의 총에 바이러스 입자 뒤에 배경을 평가하는 흠 바이러스 현탁액의 작은 나누어지는 (100 μl를 권장합니다)를 실행합니다. 이 종류에 앞서, 필요한 경우, 농도를 확인하고 정렬 게이트를 조정하는 것입니다. 우리는 바이러스 입자의 중심에 꽉 게이트를 추천합니다. 또한, 문을 생성하기 위해 우리는 SYBR 녹색과 FSC PMT 플롯을 사용합니다.
- 1 % 낮은 녹는 점 (LMP)의 5 μl를 추가 아가로 오스 (TBE 버퍼)에 각각 37 ° C로 냉각또한 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 현미경 슬라이드 (전자 현미경 과학).
- 정렬 된 바이러스 입자를 캡처하는 흐름 cytometer에에 PTFE 현미경 슬라이드를로드합니다.
- 직접 LMP 아가로 오스와 PTFE 슬라이드에 SYBR 녹색 스테인드 바이러스 입자의 정렬을 시작합니다. 우리는 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CSLM) 동안 바이러스의 깊이를 감지에 도움이 몇 가지 우물에서 10 개 이상의 이벤트 (바이러스 입자를) 정렬 좋습니다.
- 정렬이 완료되면, 흐름 cytometer에에서 슬라이드를 제거하고 추가 5 μL 더 LMP 아가 따라서 바이러스 성 입자 (들)을 포함, 각 well에 37 ° C로 냉각.
3. 공 촛점 현미경을 사용하여 단일 비리를 시각화
하나의 virion의가 필요한 경우 각도 각 바이러스를 포함하는 경우, 그 결정은 필수적이며, CLSM은 하나의 입자가 존재하고 있다는 것을 확인하는 차원에 포함 된 virion의 (들)을 시각화하는 데 필요한 여러 바이러스서로 위에 쌓인되지 않습니다.
- 파장 488 nm의 여기에 현미경 레이저를 설정합니다.
- 63X 긴 작동 거리 목표를 사용하여 포함 된 바이러스 입자 이미지.
4. 전체 게놈 증폭
- 하나의 바이러스에 우물이 CLSM으로 식별되면, 아가로 오스 (현장에서) 내에서 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 전체 게놈 증폭을 수행합니다.
- DNA 오염을 도입의 가능성을 줄이려면, 슬라이드에서 원하는 아가 '구슬'을 제거하고 멸균 PCR 튜브에 배치. 멸균 핀셋 및 / 또는이 단계 면도날의 쌍을 사용합니다.
- 현장이 thermocycler의 열 블록에서 3 분 (94 ° C) 열 사용에 바이러스 입자를 용해.
- 다음과 같이 수정하여 MDA 반응 다음과 같은 제조업체의 권장 사항 (GenomiPhi HY 키트, GE 헬스 케어)을 수행
- 시료와 반응 BUF의 볼륨을 줄입니다30 11.25 μL와 부화에 fers ° 비특이적 증폭을 줄이기 위해 2 시간의 최대 C.
- 1.7 ML 에펜 도르프 튜브에 게놈 DNA (gDNA를)를 전송하여 증폭 게놈 자료를 순화하고 1 / 10 양 TBE 버퍼에 3 M의 아세트산 나트륨 (NaOAc () 같은 버퍼 LMP 아가로 오스 준비에 사용)를 추가합니다.
- 55 장소 샘플 (가) ° C 10 분 동안 아가로 오스를 분해한다.
- 42 튜브 (들)을 이동 ° C 효소를 추가하기 전에 온도를 줄일 수 있습니다.
- 각각의 튜브와 2 시간 동안 배양 β-agarase 2 개를 추가합니다.
- 튜브 버퍼 포화 페놀 용액 1 볼륨을 추가하고, 적극적으로 혼합하고 15 분 3,500 XG에 원심 분리기. 새로운 1.7 ML 에펜 도르프 튜브에 뜨는을 포함하는 DNA를 전송합니다.
- Glycoblue 100 % 이소프로판올 및 1μL의 하나의 볼륨을 추가합니다. 반전 튜브로 잘 섞는다.
- 60 분 동안 4 ° C에서 28,000 XG에 원심 분리기. 가만히 따르다 이소프로판올 펠렛을 방해하지 않도록하고. 70 % 에탄올 150 μl를 추가각 튜브 NOL. 10 분 동안 28,000 XG와 RT에서 회전. 에탄올을 가만히 따르다, 공기는 DNA 펠렛을 건조 TE 버퍼의 적절한 볼륨 DNA를 resuspend을.
- 우리는 다음과 같은 수정을 단계 4.4-4.9를 반복 좋습니다. 3-5 복제 MDA 반응을 설정하고 1 시간에 30 부화 ° C를 줄일 수 있습니다. 원하는 농도를 얻기 위해 95~100% 에탄올을 사용하여 정화 및 침전 후 풀 샘플입니다.
5. 대표 결과
그림 1은 SVG 과정을 요약 한 것입니다. 이러한 방법은 순서에 충분 gDNA를의 수량을 얻기 위해 MDA 다음에 혼합 조립에서 하나의 바이러스 입자를 분리하는 아가로 오스를 포함하는 PTFE 현미경 슬라이드에 바이러스 입자를 정렬하는 유동 세포 계측법을 사용합니다.
증거의 개념으로, 박테리오파지 람다 및 T4는 혼합 및 SVG 과정 11 대상. 비리는 아가, CLSM 워싱턴에서 캡처 및 임베디드되자의 시각화 및 단일 virion의를 얻을되었는지 확인하는 데 사용;. 결과는 그림 2에 표시되면 하나의 비리와 우물이 확인되었다, 그들은 gDNA를의 MDA으로 선택 하였다. 우리는 T4와 격리 virion의 그림 3. 식별 할 람다 고립 된 파지 람다는 게놈 시퀀싱 선정을위한 멀티 플렉스 PCR은 특정 사용됩니다.
게놈 시퀀싱은 SVG를 사용하여 얻은 범위의 수준을 식별하는 매핑을 참조 할 대상이 된 454 티타늄 기술과 연속 읽기를 사용하여 수행 하였다. 그림 4는 거의 모든 람다 게놈 (제 5 BP의 예외) 복구되었다.
그림 1. 혼합 조립을 포함하는 SVG 방법론. 바이러스 현탁액은 다음의 아르 유동 세포 계측법을 통해 하나의 바이러스 입자로 감소개별 아가 "비즈"에 orted. 바이러스는 아가로 오스 게시물 유세포 정렬의 추가 레이어와 중첩하여 아가 로스 비드 내에 포함되어 있습니다. 마지막으로, 전체 게놈 증폭 현장에서 수행됩니다.
그림 2. 공 초점 레이저 아가로 오스 비드에 포함 된 정렬 된 바이러스 입자의 현미경을 스캔. 아가로 오스 비즈에서 SYBR 녹색 I-스테인드 바이러스 입자) 입체 재건. 삽입 : 분리 된 바이러스 입자의 높은 배율 아가로 오스 비즈에서 스테인드 하나의 바이러스 입자의 상대적 형광 B) 프로필 플롯..
그림 3. PCR을 사용하여 살균 식별.) </ strong>를 멀티 플렉스 PCR 유전자형, 레인 T4 및 람다 특정 프라이머를 사용하여 : 1. TrackIt 1킬로바이트 플러스 사다리 (Invitrogen 사), 2. 람다 integrase (750 BP), 3. T4의 주요 캡시드 단백질 (1,050 BP), 4. 1. : 람다 integrase와 T4의 주요 캡시드 단백질의 혼합 B) 추가 유전자좌와 후속 람다 특정 PCR 더 파지 게놈 격리, 레인을 확인합니다. 람다 integrase (750 BP), 2. 람다 억제 (356 BP) 3. 람다 SIE (superinfection 제외) (456 BP) 4. TrackIt 1킬로바이트 플러스 사다리 (Invitrogen 사).
그림 4. 람다 게놈 특성 및 적용.) GC 플롯, B) 람다의 게놈지도 (에서 적응 http://img.jgi.doe.gov ) 및 C) SVG의 매핑 참조 박테리오파지 람다에 대한 읽기, x 축입니다 게놈 위치, 나중에XIS는 % 범위이다.
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Discussion
SVG 방법을 적용 할 때 중요한 요소의 수를 고려해야합니다. 유전자형은 개념 증명 실험 13에서 수행 한대로 보존 된 프라이머는 모든 바이러스 그룹에서 사용할 수없는 환경 적 또는 알 수 분리에 대한 올바른 옵션이 아닙니다. 또한, 배경 DNA 합성이나 비특이적 인 증폭은 일반적으로 MDA 반응 14를 사용하여 증폭하는 동안보고됩니다. 비특이적 증폭 반응 시약 및 / 나 반응 혼합물 내의 임의의 hexamers의 증폭을 가능하게하는 메커니즘을 통해 새로운 DNA의 오염에 기인하고있다. 바이러스 군집 작업을 할 때, 우선적으로 (때문에 입자의 유의 한 차이 (셀) 크기와 게놈 DNA 내용의 결과로 하나의 박테리아 세포에 반대하는 템플릿 바이러스 DNA의 낮은 수량을 증폭 특이 DNA를의 높은 가능성은 아마도이 25-100 nm의, 바이러스에 대한 ~ 1.5 FG 등0.2-1.5 음이 아닌, 박테리아 ~ 14 FG). DNase의 I, CLSM을 사용하여 아가로 오스 비즈를 포함하는 바이러스 검사, MDA의 배양 시간의 감소 바이러스 군집의 치료 (즉, 같은 차세대 시퀀싱 기술과 능력 시퀀싱 깊이를 증가 : 다음 방법은 비특이적 증폭의 수준을 감소하는 것이 좋습니다 454 - 티타늄 일루미나 같은).
환경 시료에 SVG를 수행 할 때 최적화 드 노보 어셈블리 전체 또는 거의 완전한 게놈 서열을 얻기 위해 필수적입니다. 우리는 중복을 줄이는 것은 조립하기 전에 큰 범위 13를 얻을 필요가 읽는 것으로 나타났습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 원고 준비 과정을 통해 자신의 통찰력과 조언 켄 Nealson에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
