Summary
علم الجينوم فيروس واحد (SVG) هو وسيلة لعزل وتضخيم الجينوم من virons واحد. يتم تصنيف معلقات الفيروسية من تجمع مختلط باستخدام التدفق الخلوي على شريحة المجهر مع آبار منفصلة تحتوي على الاغاروز، وبالتالي الاستيلاء على الفيريون والحد من قص الجينوم أثناء التجهيز النهائي. ويتم تحقيق كامل الجينوم التضخيم متعددة باستخدام التضخيم التشرد (MDA) مما أدى إلى المواد الجينية التي هي مناسبة لتسلسل.
Abstract
كامل الجينوم التضخيم وتسلسل الخلايا الميكروبية واحدة تمكن توصيف الجيني من دون الحاجة إلى زراعة 1-3. الفيروسات، والتي هي في كل مكان والكيانات الأكثر عددا على كوكبنا 4 وهامة في جميع البيئات 5، لم يتم الكشف عنها عن طريق نهج مماثلة. نحن هنا وصف نهج لعزل وتوصيف العوامل الوراثية من virions واحد يسمى "علم الجينوم فيروس واحد '(SVG). SVG تستخدم التدفق الخلوي لعزل الفيروسات الفردية والتضخيم كله الجينوم للحصول على ارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي الجيني (gDNA) التي يمكن استخدامها في التفاعلات التسلسل اللاحقة.
Protocol
1. إعداد معلقات الفيروسية
قبل عزل virions واحدة عن طريق التدفق الخلوي، وإعداد معلقات الفيروسية غير المثبتة.
- عزل الجزيئات الفيروسية باستخدام البروتوكولات المعمول بها سابقا والتأكد من التعليق الفيروسية النهائي يرد في 0.1 ميكرون تصفية TE (تريس، EDTA، ودرجة الحموضة 8). نوصي باستخدام الترشيح تدفق عرضية (TFF) تقترب 6 على الرغم من أن وضعت أساليب أخرى أن استخدام المواد الكيميائية التلبد 7.
- تعداد الجسيمات الفيروسية باستخدام بروتوكولات المعمول بها، على سبيل المثال باستخدام 8-10 epifluorescence أو التدفق الخلوي 11،12.
- قسامة تعليق الفيروسية إلى قسمين أنابيب إيبندورف (ينصح الحجم النهائي ليكون 1،000 ميكرولتر).
2. التدفق الخلوي
- لفرز الفيروسات باستخدام BD FACSAria II تدفق عداد الكريات مجهزة مخصصة PMT مبعثر إلى الأمام (FSC PMT)، وتمييع الجسيمات الفيروسية في 0.1 ميكرون تصفية TE، ودرجة الحموضة 8.0 إلى عيار المناسبة لمعدل حدث من الأحداث 200 ثانية -1.
- تعيين عتبات لتعظيم حصص إشارة إلى الضوضاء، على سبيل المثال. لتجميع المختلطة التي تحتوي على جزيئات فج T4 وامدا التالية ينصح: PMT FSC في 1،000 وSSC في 200.
- تشغيل 100 ميكرولتر من عينات "على بياض" يحتوي فقط 1) 0.1 ميكرون تصفية TE و 2) 0.1 ميكرون تصفية TE وSybrGreen1 في 1E-4 التخفيف من الأوراق المالية (10،000 X).
- تشغيل قسامة الصغيرة (ينصح 100 ميكرولتر) من التعليق الفيروسية غير ملوثين لتقييم الخلفية، تليها التعليق الفيروسية الملون (SybrGreen1 في 1E-4 التخفيف من الأسهم)، والجسيمات الفيروسية إلى ما مجموعه 5،000 الأحداث لكل منهما. هذا هو للتحقق من التركيز وضبط بوابات الفرز، وإذا لزم الأمر، قبل الفرز. نوصي بوابة ضيقة في وسط الجسيمات الفيروسية. أيضا، لتوليد بوابات نستخدم الأخضر SYBR وFSC PMT المؤامرة.
- إضافة 5 ميكرولتر من 1٪ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز (في TBE العازلة) تبريده الى 37 درجة مئوية إلى كلجيدا على بولي تترافلوروإيثيلين (السليكوون) شريحة المجهر (علوم المجهر الإلكتروني).
- تحميل شريحة المجهر السليكوون في تدفق عداد الكريات لالتقاط الجسيمات الفيروسية التي تم فرزها.
- يبدأ نوع من SYBR الخضراء الجسيمات الفيروسية الملون مباشرة على الشريحة مع السليكوون LMP الاغاروز. نوصي فرز 10 أو أكثر من الأحداث (الجسيمات الفيروسية) في بعض الآبار للمساعدة في الكشف عن عمق الفيروسات أثناء المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري (CSLM).
- عندما يكون الترتيب اكتمال إزالة شريحة من تدفق عداد الكريات وإضافة 5 ميكرولتر تبريده أكثر LMP الاغاروز إلى 37 ° C إلى كل بئر، وبالتالي تضمين الجسيمات الفيروسية (ق).
3. تصور Virions واحدة باستخدام المجهر متحد البؤر
إذا هو المطلوب الفيريون واحدة، ثم تحديد ما إذا كان يحتوي على كل بئر فيروس الفردية أمر حتمي وضروري CLSM لتصور الفيريون جزءا لا يتجزأ من (ق) في 3D للتحقق من أنه ليس هناك سوى جسيم واحد هو الحاضر وأن الفيروسات متعددةلم يتم مكدسة فوق بعضها البعض.
- تعيين الليزر المجهر لطول الموجة 488 نانومتر الإثارة.
- صورة الجزيئات الفيروسية جزءا لا يتجزأ باستخدام 63X الهدف طويل بعد العمل.
4. كامل التضخيم الجينوم
- وبمجرد تحديد الآبار مع الفيروسات واحد مع CLSM، نفذ التضخيم الجينوم بأكمله باستخدام عدة التضخيم التشرد (MDA) في الاغاروز (في الموقع).
- لتقليل احتمال تلوث إدخال الحمض النووي، وإزالة 'الخرز' الاغاروز المطلوب من الشريحة ووضعها في أنبوب PCR العقيمة. استخدام زوج من ملاقط معقمة و / أو شفرة حلاقة لهذه الخطوة.
- ليز الجسيمات الفيروسية في الموقع باستخدام الحرارة (94 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق في كتلة الحرارة من thermocycler.
- تنفيذ التوصيات التالية رد فعل MDA الشركة الصانعة (GenomiPhi HY عدة، GE للرعاية الصحية) مع إجراء التعديلات التالية
- تقليص حجم العينة وBUF رد فعلنظام تقاعد الموظفين الاتحاديين إلى 11.25 ميكرولتر واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 ساعة للحد من التضخيم غير محددة.
- تنقية المواد الجينية تضخيمها عن طريق نقل الحمض النووي الجيني (gDNA) إلى 1.7 مل أنبوب إيبندورف وإضافة حجم 1/10 3 M خلات الصوديوم (NaOAc) في TBE العازلة (نفس العازلة المستخدمة في إعداد الاغاروز LMP).
- عينة مكان (ق) في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإذابة الاغاروز.
- نقل أنبوب (ق) إلى 42 درجة مئوية لخفض درجة الحرارة قبل إضافة انزيم.
- إضافة 2 وحدات β-agarase إلى كل أنبوب واحتضان لمدة 2 ساعة.
- إضافة 1 حجم من محلول الفينول العازلة المشبعة إلى أنبوب، ومزيج بقوة والطرد المركزي في 3،500 x ج لمدة 15 دقيقة. نقل طاف تحتوي على الحمض النووي لجديد 1.7 مل أنبوب إيبندورف.
- إضافة مجلد واحد من 100٪ الأيزوبروبانول و1μl من Glycoblue. مزيج جيد من قبل أنبوب قلب.
- الطرد المركزي في XG 28،000 في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. صب الأيزوبروبانول التأكد من عدم تعكير صفو بيليه. إضافة 150 ميكرولتر من 70٪ ethaنول لكل أنبوب. تدور في 28،000 XG وRT لمدة 10 دقيقة. صب الإيثانول، والهواء الجاف بيليه الحمض النووي DNA و resuspend في حجم مناسب من TE العازلة.
- نوصي بتكرار الخطوات 4،4-4،9 مع التعديلات التالية. إعداد 3-5 ردود فعل MDA تكرار والحد من الحضانة عند 30 درجة مئوية إلى 1 ساعة. عينات تجمع بعد تنقية ويعجل باستخدام 95-100٪ من الإيثانول للحصول على التركيز المطلوب.
5. ممثل النتائج
يلخص الشكل 1 عملية SVG. هذه الأساليب استخدام التدفق الخلوي لفرز الجزيئات الفيروسية على شرائح المجهر السليكوون تحتوي على الاغاروز لعزل virions واحد من تجمع مختلط تليها MDA للحصول على كميات من gDNA التي هي كافية لتسلسل.
ونتيجة لإثبات صحة المفهوم، كانت مختلطة البكتيريا امدا وT4 وتعرض لعملية SVG 11. مرة واحدة تم القبض virions وجزءا لا يتجزأ في الاغاروز، CLSM واق المستخدمة لتصور وتأكيد أن الفيريون واحد تم الحصول عليها؛. وترد النتائج في الشكل 2 مرة واحدة وقد تم تحديد الآبار مع virions واحد، تم اختيارهم لنجمة داود الحمراء من gDNA. ثم استخدمنا متعددة PCR محددة لT4 وامدا لتحديد الفيريون معزولة، الشكل (3). وقد تم اختيار معزولة فج امدا لتسلسل الجينوم.
تم إجراء تسلسل الجينوم باستخدام تقنية 454-التيتانيوم وتسلسل قراءة تعرضوا للمرجع رسم الخرائط لتحديد مستوى التغطية الحصول عليها باستخدام SVG. الشكل 4 يبين أن تم استرداد ما يقرب من الجينوم امدا بأكمله (مع استثناء من BP أول 5).
الشكل 1. يتم تخفيض SVG منهجية. الايقاف الفيروسية التي تحتوي على تجميع مختلطة لجسيمات فيروس واحد عن طريق التدفق الخلوي التي هي ثم sorted على الفرد الاغاروز "الخرز". تم تضمين الفيروس ضمن الاغاروز حبة من قبل تتراكب مع طبقة إضافية من الاغاروز آخر تدفق cytometric الفرز. وأخيرا، يتم تنفيذ كامل التضخيم الجينوم في الموقع.
الشكل 2. ليزر متحد البؤر المسح صورة مجهرية من الجسيمات الفيروسية مصنفة مضمن في الاغاروز حبة. A) ثلاثة الأبعاد لإعادة الإعمار SYBR الأخضر الجسيمات الفيروسية I-الملون داخل الاغاروز حبة. أقحم: التكبير أعلى من الجسيمات الفيروسية المعزولة B) مؤامرة الشخصي من مضان النسبية للجسيمات فيروسية واحد الملون داخل الاغاروز حبة.
الشكل (3). تحديد الجراثيم باستخدام PCR. A) </ STRONG> متعددة PCR باستخدام بادئات T4 وامدا محددة إلى التركيب الوراثي، والممرات: 1. TrackIt 1 كيلوبايت زائد سلم (إينفيتروجن)، 2. امدا integrase (750 BP)، 3. T4 البروتين قفيصة الرئيسية (1،050 BP)، 4. . مزيج من امدا integrase وT4 البروتين قفيصة الرئيسية B) لاحقا لامدا محددة PCR مع مواضع إضافية لزيادة تأكيد فج العزلة الجينوم، والممرات: 1. امدا integrase (750 BP)، 2. امدا كاظمة (356 BP) 3. امدا SIE (استبعاد عدوى) (456 BP) 4. TrackIt 1 كيلوبايت زائد سلم (إينفيتروجن).
الشكل 4. امدا سمات الجينوم والتغطية. A) GC مؤامرة، B) خريطة الجينوم لامدا (مقتبس من http://img.jgi.doe.gov )، وC) رسم الخرائط من SVG يقرأ على الإشارة البكتيريا امدا، محور س هو موقف الجينوم، ياxis هو التغطية٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يجب اتخاذ عدد من العوامل الهامة في الاعتبار عند تطبيق النهج SVG. التنميط الجيني، كما تم تنفيذ خلال إثبات صحة مفهوم التجربة 13، ليس خيارا صالحا للعزلة البيئية أو غير معروف كما الاشعال الحفظ غير متوفرة في جميع الفئات الفيروسية. أيضا، يتم الإبلاغ خلفية توليف الحمض النووي أو التضخيم غير محددة عادة خلال التضخيم باستخدام تفاعل MDA 14. ويعزى التضخيم غير محددة إلى تلويث الحمض النووي الخارجة من الكواشف رد فعل و / أو من خلال آلية تمكن التضخيم من hexamers عشوائية داخل خليط التفاعل. عند العمل مع تجمعات الفيروسية، وهناك ربما وجود احتمال أعلى من السلطات الوطنية المعينة غير محدد تضخيم تفضيلي نظرا لكمية أقل من قالب الحمض النووي الفيروسي بدلا من الخلايا البكتيرية واحد نتيجة للاختلاف الكبير في الجسيمات (الخلية) حجم ومحتوى الحمض النووي الجيني ( 25-100 نانومتر؛ ~ 1.5 FG للبحث عن الفيروسات، كماتعارض 0،2-1،5 أم؛ ~ 14 FG للبكتيريا). ينصح الأساليب التالية لخفض مستوى التضخيم غير محددة: علاج تجمعات الفيروسية مع الدناز أنا، والفحص من الفيروسات التي تحتوي على حبات الاغاروز باستخدام CLSM، والحد من MDA فترة حضانة وزيادة عمق التسلسل (أي كما هو قادر مع تقنيات التسلسل من الجيل التالي مثل 454-التيتانيوم والبورشيد).
عند تنفيذ SVG على العينات البيئية، دي نوفو الجمعية الأمثل لا بد من الحصول الكامل أو شبه الكامل متواليات الجينوم. لقد وجدنا أن الحد من يقرأ زائدة قبل الجمعية هو ضروري للحصول على تغطية أكبر 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونود أن نشكر كين نيلسون لبصيرته والمشورة في جميع مراحل عملية إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
