Summary
Enkelt virus Genomics (SVG) er en metode til at isolere og amplificere genomer af enkelte vironer. Virale suspensioner af en blandet samling sorteres ved hjælp af flowcytometri på et objektglas med diskrete brønde indeholdende agarose, derved opfange virionet og reducere genom stabklipning under nedstrøms behandling. Hele genomet forstærkning opnås ved anvendelse af multiple forskydning forstærkning (MDA) resulterer i genomisk materiale, der er egnet til sekventering.
Abstract
Hele genomet amplifikation og sekventering af enkelte mikrobielle celler muliggør genomkarakterisering uden behov for dyrkning 1-3. Vira, som er allestedsnærværende og de mest talrige enheder på vores planet 4 og vigtigt i alle miljøer 5, er endnu ikke afsløret via lignende tiltag. Her beskriver vi en metode til at isolere og karakterisere genomer af enlige virioner kaldet 'enkelt virus Genomics' (SVG). SVG udnytter flowcytometri at isolere enkelte vira og hele genomet forstærkning for at opnå høj molekylvægt genomisk DNA (gDNA), der kan anvendes i efterfølgende sekventeringsreaktioner.
Protocol
1.. Fremstilling af virale suspensioner
Før isoleringen af de enkelte virioner via flowcytometri, forberede ufikserede virale suspensioner.
- Isoler virale partikler ved anvendelse af tidligere etablerede protokoller gør sikker endelig viral suspension er indeholdt i 0,1 um-filtreret TE (Tris-EDTA, pH 8). Vi anbefaler at bruge tangentielstrømningsfiltrering (TFF) nærmer 6 selv om andre metoder er blevet udviklet, at brugen kemisk flokkulering 7..
- Optælle virale partikler ved hjælp af fastlagte protokoller, fx ved hjælp af epifluorescens 8-10 eller flowcytometri 11,12.
- Alikvot viral suspension i to Eppendorf-rør (endelig volumen anbefales at være 1.000 ul).
2.. Flowcytometri
- Hvis du vil sortere virus vha. BD FACSAria II flowcytometer udstyret med en brugerdefineret Forward Scatter PMT (FSC PMT), fortyndes virale partikler i 0,1 um-filtreret TE, pH 8.0 til en passende titer til en begivenhed på 200 arrangementer sek -1.
- Fastsætte tærskelværdier for at maksimere signal-støj rationer, f.eks. for en blandet samling, der indeholder T4 og lambda fag-partikler følgende anbefales: FSC PMT ved 1.000 og SSC ved 200.
- Kør 100 ul "blanke" prøver, der kun indeholder 1) 0.1 um-filtreret TE og 2) 0,1 um-filtreret TE og SybrGreen1 på 1e-4 fortynding af lager (10.000 X).
- Køre en lille portion (100 ul anbefales) af ufarvet virussuspension at vurdere baggrunden, efterfulgt af farvede virussuspension (SybrGreen1 på 1e-4 fortynding af stamopløsning), virale partikler til i alt 5.000 hændelser hver. Dette er for at kontrollere koncentrationen og justere sortering porte, hvis det er nødvendigt, før sortering. Vi anbefaler en stram port i centrum af virale partikler. Også for at generere porte vi bruger SYBR Green og FSC PMT plot.
- Tilsættes 5 ul 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose (i TBE-buffer), afkølet til 37 ° C til hvergodt på en polytetrafluorethylen (PTFE) mikroskopobjektglas (Electron Microscopy Sciences).
- Indlæse PTFE objektglas i flowcytometeret at fange sorteret viruspartikler.
- Begynd slags SYBR green farvede viruspartikler direkte på PTFE objektglas med LMP agarose. Vi anbefaler, sortering 10 eller flere hændelser (viruspartikler) i visse brønde til støtte i afsløring af dybden af virus under konfokal laserscanning mikroskopi (CSLM).
- Når sortering er afsluttet, fjernes objektglasset fra flowcytometeret og tilsættes 5 ul mere LMP agarose afkøles til 37 ° C til hver brønd, således at indlejre den virale partikel (r).
3.. Visualisering Enkelt Virioner hjælp konfokal mikroskopi
Hvis en enkelt virion ønskes, så afgøre, om hver brønd indeholder en individuel virus er afgørende og CLSM er nødvendig for at visualisere den integrerede virion (r) i 3D at kontrollere, at kun en enkelt partikel er til stede, og at flere viraikke stables oven på hinanden.
- Indstil mikroskopet laser til bølgelængden 488 nm excitation.
- Billede de indlejrede viruspartikler ved hjælp af en 63X lang arbejdsafstand mål.
4.. Hele genomet Amplification
- Når brønde med enkelt virus er identificeret med CLSM, udføre hele genomet forstærkning ved hjælp af flere forskydning forstærkning (MDA) i agarose (in situ).
- For at mindske sandsynligheden for at indføre DNA forurening fjernes de ønskede agarose 'perler' fra slæden og anbringes i et sterilt PCR-rør. Brug et par sterile pincetter og / eller barberblad til dette trin.
- Lyse viruspartiklen in situ ved hjælp af varme (94 ° C) i 3 minutter i varmen blok af en thermocycler.
- Udfør MDA reaktion efter producentens anbefalinger (GenomiPhi HY kit, GE Healthcare) med følgende modifikationer
- Reducer mængden af prøven og reaktion bufførsler til 11.25 ul og inkuberes ved 30 ° C i maksimalt 2 hr at reducere uspecifik forstærkning.
- Renses det amplificerede genmateriale ved overførsel genomisk DNA (gDNA) til en 1,7 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes 1/10 rumfang 3 M natriumacetat (NaOAc) i TBE-puffer (samme puffer anvendes i LMP agarose forberedelse).
- Prøven anbringes (s) ved 55 ° C i 10 minutter for at opløse agarose.
- Flyt røret (rørene) til 42 ° C for at reducere temperaturen før tilsætning enzym.
- Tilsæt 2 enheder β-agarase til hvert rør og inkuberes i 2 timer.
- Tilsæt 1 volumen af en puffer-mættet phenol løsning til røret, der blandes kraftigt og centrifugeres ved 3.500 xg i 15 min. Overfør supernatant indeholdende DNA til en ny 1,7 ml Eppendorf-rør.
- Tilsæt en volumen på 100% isopropanol og 1 pi af Glycoblue. Bland godt ved at vende røret.
- Centrifugeres ved 28.000 xg ved 4 ° C i 60 min. Dekantér isopropanol og sørg for ikke at forstyrre bundfaldet. Tilsæt 150 ul 70% ethanol til hvert rør. Spin på 28.000 xg og RT i 10 min. Dekanteres ethanol, lufttørre DNA-pelleten og resuspender DNA'et i en passende volumen af TE-buffer.
- Vi anbefaler at gentage trin 4,4-4,9 med følgende ændringer. Opsæt 3-5 gentagne MDA reaktioner og reducere inkubation ved 30 ° C til 1 time. Pool prøver efter rensning og bundfald med 95-100% ethanol for at opnå den ønskede koncentration.
5.. Repræsentative resultater
Figur 1 opsummerer SVG proces. Disse metoder bruger flowcytometri at sortere virale partikler på PTFE objektglas indeholdende agarose at isolere enkelte virioner fra en blandet samling efterfulgt af MDA at opnå mængder gDNA, som er tilstrækkelige til sekventering.
Som et proof-of-concept, blev bakteriofag lambda og T4 blandes og underkastes den SVG-processen 11.. Når virioner blev fanget og indlejret i agarose, CLSM was bruges til at visualisere og bekræfte, at en enkelt virion blev givet. Resultaterne er vist i figur 2 Når brønde med enkelte virioner blev identificeret, blev de udvalgt til MDA af gDNA. Vi derefter brugt multiplex-PCR specifik for T4 og lambda at identificere den isolerede virion, fig. 3. En isoleret fag lambda blev udvalgt til genom sekventering.
Genom-sekventering blev udført under anvendelse 454-Titanium teknologi og sekventering læser blev underkastet referere kortlægning at identificere den dækning opnået ved anvendelse af SVG. Figur 4 viser, at næsten hele lambda-genomet blev udvundet (med undtagelse af de første 5 bp).
Figur 1. SVG metodologi. Viral opslæmninger indeholdende en blandet forsamling er reduceret til en enkelt viruspartikler via flowcytometri, som så sorted på individuelle agarose "perler". Viruset er indlejret i agarose perle ved overlejring med et ekstra lag af agarose efter flowcytometrisk sortering. Endelig er hele genomet amplifikation udført in situ.
Figur 2. Konfokal laserscanning mikrograf af en sorteret viruspartikel indlejret i en agarose perle. A) Tredimensionelle rekonstruktion af en Sybr Green I-farvede viruspartikel i en agarose perle. Indsat: højere forstørrelse af det isolerede virale partikel B) Profil plot af relativ fluorescens af farvede enkelt virale partikel i en agarose perle..
Figur 3. Bakteriofag identifikation ved anvendelse af PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR under anvendelse T4 og lambda-specifikke primere til genotype, bane 1. TrackIt 1 kb plus stigen (Invitrogen), 2. lambda integrase (750 bp), 3. T4 kapsidproteinet protein (1.050 bp), 4. . Blanding af lambda-integrase og T4 kapsidproteinet protein B) Efter lambda specifikke PCR med yderligere loci yderligere bekræfte faggenom isolation, Lanes: 1.. Lambda integrase (750 bp), 2. Lambda-repressoren (356 bp) 3. Lambda sie (superinfektion udstødelse) (456 bp) 4.. TrackIt 1 kb plus stigen (Invitrogen).
Figur 4.. Lambda genom attributter og dækning. A) GC plot, B) Genome kort over lambda (tilpasset fra http://img.jgi.doe.gov ) og C) Kortlægning af SVG læser til referencen bakteriofag lambda, x-aksen er genom position, yaXis er% dækning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En række vigtige faktorer skal tages i betragtning, når de anvender SVG tilgange. Genotypebestemmelse, som blev udført under proof-of-concept eksperiment 13, er ikke en gyldig løsning for miljø eller ukendte isolater som bevarede primere ikke er tilgængelige på tværs af alle virale grupper. Desuden er baggrunden dna-syntese eller uspecifik forstærkning almindeligt rapporteret under opformering ved hjælp af MDA reaktionen 14.. Uspecifik amplifikation er blevet tilskrevet kontaminerende DNA vej fra reaktionsreagenser og / eller via en mekanisme, der muliggør amplifikation af de tilfældige hexamerer i reaktionsblandingen. Når man arbejder med virale assemblager, der er måske en højere sandsynlighed for uspecifikke DNA'er fortrinsvis forstærket på grund af den lavere mængde af skabelon viralt DNA i modsætning til enkelt bakterieceller som følge af den betydelige forskel i partikel (celle) størrelse og genomisk DNA indhold ( 25-100 nm ~ 1,5 fg for virus, somi modsætning til 0,2-1,5 um, ~ 14 fg for bakterier). Følgende metoder anbefales at reducere niveauet af uspecifik forstærkning: behandling af virale assemblager med DNase I, undersøgelse af virus indeholdende agarosekugler hjælp CLSM, reduktion af MDA inkubationstid og øget sekventering dybde (dvs. som er i stand til med næste generation sekventering teknologier ligesom 454-Titan og Illumina).
Når du udfører SVG på miljøprøver, optimeret de novo samling er bydende nødvendigt at opnå fuldstændig eller næsten fuldstændig genomsekvenser. Vi har fundet, at reducere overflødige læser før samling er nødvendig for at opnå større dækning 13..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Ken Nealson for hans indsigt og rådgivning under hele manuskriptet forberedelsesprocessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
