Summary
Genomica singolo virus (SVG) è un metodo per isolare e amplificare il genoma di singoli virons. Sospensioni virali di un assemblaggio misto sono ordinati mediante citometria a flusso su un vetrino da microscopio con pozzi discrete contenenti agarosio, catturando così il virione e la riduzione del genoma taglio durante la lavorazione a valle. Intero genoma amplificazione viene ottenuta utilizzando multipla di amplificazione dello spostamento (MDA) risultante in materiale genomico che è adatto per il sequenziamento.
Abstract
Tutta l'amplificazione e sequenziamento del genoma delle cellule microbiche singole consente caratterizzazione genomica, senza la necessità di coltivazione 1-3. I virus, che sono onnipresenti e le più numerose entità sul nostro pianeta 4 e importante in tutti gli ambienti 5, devono ancora essere rivelati tramite approcci simili. Qui si descrive un metodo per isolare e caratterizzare il genoma di singoli virioni chiamati "Genomica singolo virus" (SVG). SVG utilizza citometria a flusso per isolare singoli virus e amplificazione del genoma intero di ottenere un'elevata molecolare DNA genomico peso (gDNA) che può essere utilizzato nelle successive reazioni di sequenziamento.
Protocol
1. Preparazione di sospensioni virali
Prima di isolamento dei singoli virioni tramite citometria a flusso, preparare sospensioni virali non fissati.
- Isolare particelle virali che utilizzano i protocolli stabiliti in precedenza facendo attenzione sospensione virale finale è contenuto in 0,1 micron-filtrata TE (Tris-EDTA, pH 8). Si consiglia di utilizzare filtrazione a flusso tangenziale (TFF) avvicina 6 anche se altri metodi sono stati sviluppati che uso chimico flocculazione 7.
- Enumerare le particelle virali che utilizzano protocolli stabiliti, per esempio usando 8-10 epifluorescenza o citometria a flusso 11,12.
- Aliquota sospensione virale in due provette Eppendorf (volume finale è raccomandato per essere 1.000 ml).
2. Citometria a Flusso
- Per ordinare i virus utilizzando la BD FACSAria II Citofluorimetro dotato di un PMT diffusione frontale personalizzato (FSC PMT), diluire le particelle virali in 0,1 micron-filtrata TE, pH 8.0 ad un titolo appropriato per un tasso di eventi di 200 eventi sec -1.
- Impostare le soglie per massimizzare razioni segnale-rumore, ad es. per un assemblaggio misto contenente particelle di fago T4 e lambda seguenti sono raccomandati: FSC PMT a 1.000 e SSC a 200.
- Run 100 ml di campioni di "vuoti" che contengono solo 1) 0,1 micron TE-filtrata e 2) 0,1 micron TE-filtrata e SybrGreen1 a 1e-4 diluizione di magazzino (10.000 X).
- Eseguire una piccola aliquota (si consiglia 100 ml) di sospensione virale senza macchia per valutare sfondo, seguita dalla sospensione virale macchiato (SybrGreen1 a 1e-4 diluizione di magazzino), le particelle virali per un totale di 5.000 eventi ciascuno. Questo è per controllare e regolare la concentrazione cancelletti di smistamento, se necessario, prima di ordinamento. Si consiglia un cancello stretto nel centro di particelle virali. Inoltre, per la generazione di cancelli usiamo il SYBR Green e FSC PMT trama.
- Aggiungere 5 ml di 1% basso punto di fusione (LMP) agarosio (in tampone TBE) raffreddata a 37 ° C per ciascunbene su un politetrafluoroetilene (PTFE) vetrino da microscopio (Scienze della microscopia elettronica).
- Caricare il vetrino da microscopio in PTFE nel citofluorimetro per catturare particelle virali ordinati.
- Inizia sorta di particelle virali macchiati SYBR Green direttamente sul PTFE diapositiva con LMP agarosio. Si consiglia di cernita 10 o più eventi (particelle virali) in alcuni pozzi per aiutare nella rilevazione della profondità di virus durante microscopia confocale laser a scansione (CSLM).
- Quando l'ordinamento è completo, rimuovere diapositive dal citofluorimetro e aggiungere 5 ml più LMP agarosio raffreddato a 37 ° C in ogni pozzetto, incorporando così la particella virale (s).
3. Visualizzare Virioni singoli usando la microscopia confocale
Se si desidera un singolo virione, quindi determinare se ciascun pozzetto contiene un virus individuo è imperativa e CLSM è necessario per visualizzare il virione incorporato (s) in 3D per verificare che una sola particella è presente e che molti virusnon sono impilati uno sopra l'altro.
- Impostare il microscopio laser alla lunghezza d'onda di 488 nm di eccitazione.
- Immagine le particelle virali embedded utilizzando un obiettivo 63X lunga distanza di lavoro.
4. Whole Genome Amplification
- Una volta pozzetti con singoli virus sono identificati con CLSM, eseguire tutta amplificazione del genoma utilizzando più di amplificazione dello spostamento (MDA) nel agarosio (in situ).
- Per diminuire la probabilità di introdurre contaminazioni DNA, rimuovere l'agarosio 'perle' desiderate dal vetrino e messo in una provetta sterile PCR. Utilizzare un paio di pinzette sterili e / o lama di rasoio per questo passo.
- Lisare la particella virale in situ utilizzando il calore (94 ° C) per 3 minuti nel blocco termico di un termociclatore.
- Eseguire raccomandazioni MDA reazione seguente del produttore (GenomiPhi kit HY, GE Healthcare), con le seguenti modifiche
- Ridurre il volume del campione e buf reazionefers a 11,25 e incubare a 30 ° C per un massimo di 2 ore per ridurre l'amplificazione non specifica.
- Purificare il materiale genomico amplificato mediante il trasferimento di DNA genomico (gDNA) ad una provetta Eppendorf 1,7 e aggiungere 1/10 del volume 3 M di acetato di sodio (NaOAc) in tampone TBE (stesso tampone utilizzato nella preparazione di agarosio LMP).
- Collocare il campione (s) a 55 ° C per 10 minuti per sciogliere agarosio.
- Spostare tubo (s) a 42 ° C per ridurre la temperatura prima di aggiungere enzima.
- Aggiungere 2 unità β-agarase a ciascuna provetta e incubare per 2 ore.
- Aggiungere 1 volume di una soluzione satura di fenolo tampone al tubo, mescolare vigorosamente e centrifugare a 3500 xg per 15 min. Trasferire il supernatante contenente DNA ad una nuova provetta Eppendorf 1,7 ml.
- Aggiungere un volume di 100% di isopropanolo e 1ml di Glycoblue. Mescolare bene con la metropolitana invertendo.
- Centrifugare a 28.000 xg a 4 ° C per 60 min. Decantare isopropanolo facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 150 ml di 70% ethaNol ad ogni provetta. Spin a 28.000 xg e RT per 10 min. Decantare l'etanolo, l'aria secca il pellet di DNA e risospendere il DNA in un volume adeguato di tampone TE.
- Si consiglia di ripetere passaggi 4,4-4,9 con le seguenti modifiche. Impostare 3-5 replicano reazioni MDA e ridurre l'incubazione a 30 ° C per 1 ora. Campioni Pool dopo purificazione e precipitato con 95-100% di etanolo per ottenere la concentrazione desiderata.
5. Rappresentante dei risultati
La Figura 1 riassume il processo di SVG. Questi metodi utilizzano la citometria a flusso per ordinare particelle virali sul PTFE vetrini contenenti agarosio per isolare singoli virioni da un assemblaggio misto seguito da MDA per ottenere quantità di gDNA che sono sufficienti per il sequenziamento.
Come-di-concetto prova, batteriofago lambda e T4 sono stati mescolati e sottoposti al processo SVG 11. Una volta virioni sono stati catturati e inseriti in agarosio, CLSM was usato per visualizzare e confermare che un singolo virione è stato ottenuto;. risultati sono mostrati nella Figura 2 Una volta pozzetti con singoli virioni sono stati identificati, sono stati selezionati per MDA di gDNA. Abbiamo poi utilizzato multiplex PCR specifica per T4 e lambda per identificare il virione isolato, Figura 3. Un isolato fago lambda è stato selezionato per il sequenziamento del genoma.
Sequenziamento del genoma è stata effettuata utilizzando la tecnologia 454-titanio e sequenziamento letture sono stati sottoposti a mappatura riferimento per identificare il livello di copertura ottenuta utilizzando SVG. Figura 4 mostra che quasi l'intero genoma lambda stato recuperato (con l'eccezione dei primi 5 bp).
Figura 1. SVG metodologia. Sospensioni virali contenenti un assemblaggio misto sono ridotti a particelle di virus singoli tramite citometria di flusso che sono poi sorted sui singoli agarosio "perle". Il virus è inserita all'interno del agarosio tallone sovrapponendo con un ulteriore strato di agarosio messaggio flusso ordinamento citometria. Infine, amplificazione del genoma intero viene eseguita in situ.
Figura 2. Scansione laser confocale micrografia di una particella virale ordinato incorporato in una perlina di agarosio. A) Ricostruzione tridimensionale di una particella virale SYBR Green I-stained all'interno di una perlina di agarosio. Nel riquadro: un ingrandimento maggiore della particella virale isolato B) Profilo appezzamento di fluorescenza relativa della particella virale singolo macchiato all'interno di un cordone di agarosio..
Figura 3. Identificazione batteriofago mediante PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR utilizzando primer T4 e lambda-specifico genotipo, Lanes: 1. TrackIt 1 kb più contatti (Invitrogen), 2. lambda integrasi (750 bp), 3. T4 principale proteina del capside (1.050 bp), 4. . Mix di lambda integrasi e T4 principale proteina del capside B) Dopo la PCR specifico lambda con loci supplementari per confermare ulteriormente fago isolamento genoma, Lanes: 1. Lambda integrasi (750 bp), 2. Lambda repressore (356 bp) 3. Lambda sie (superinfezione esclusione) (456 bp) 4. TrackIt 1 kb più contatti (Invitrogen).
Figura 4. Lambda attributi del genoma e la copertura a.) GC trama, B) Genoma mappa di lambda (adattato da http://img.jgi.doe.gov ), e C) Mappatura di SVG legge al riferimento batteriofago lambda, asse x è posizione genoma, yaxis è% di copertura.
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Discussion
Un certo numero di fattori importanti devono essere prese in considerazione nell'applicazione di approcci SVG. Genotipizzazione, come è stato eseguito durante il proof-of-concept esperimento 13, non è un'opzione valida per gli isolati ambientali o sconosciute come primer conservati non sono disponibili in tutti i gruppi virali. Inoltre, sfondo sintesi del DNA o amplificazione aspecifica è comunemente riportati durante l'amplificazione mediante la reazione di MDA 14. Amplificazione non specifica è stata attribuita a DNA contaminante emergente dai reagenti di reazione e / o tramite un meccanismo che permette l'amplificazione dalle esameri casuali all'interno della miscela di reazione. Quando si lavora con assemblaggi virali, c'è forse una maggiore probabilità di DNA amplificati aspecifici preferenzialmente dovuta alla minore quantità di DNA virale template al contrario di singole cellule batteriche come risultato della differenza significativa nella particella (cella) formato e contenuto di DNA genomico ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg per i virus, comeinvece di 0,2-1,5 um; ~ 14 fg per i batteri). Si raccomandano i seguenti metodi per ridurre il livello di amplificazione non specifica: trattamento di assemblaggi virali con DNasi I, l'esame di virus contenente microsfere di agarosio utilizzando CLSM, riduzione di MDA tempo di incubazione e una maggiore profondità di sequenziamento (vale a dire come è in grado con tecnologie di prossima generazione di sequenziamento come 454-Titanio e Illumina).
Durante l'esecuzione di SVG in campioni ambientali, de novo assemblaggio ottimizzato è indispensabile per ottenere sequenze genomiche complete o quasi complete. Abbiamo trovato che la riduzione del ridondante legge prima dell'assemblaggio è necessaria per ottenere una maggiore copertura 13.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Ken Nealson per la sua intuizione e consulenza durante tutto il processo di preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
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