Summary
Одноместный геномики Вирус (SVG) является методом, чтобы изолировать и усилить геномы одного вирионов. Вирусные суспензий смешанной сборкой сортируются с использованием проточной цитометрии на предметное стекло микроскопа с дискретными лунки, содержащие агарозы, тем самым захватив вириона и сокращение генома сдвига во время последующей обработки. Амплификация полного генома достигается использованием нескольких усиления смещения (MDA), в результате геномный материал, который подходит для секвенирования.
Abstract
Амплификация полного генома и секвенирование одного микробных клеток позволяет геномной характеристики без необходимости выращивания 1-3. Вирусы, которые повсеместно и самыми многочисленными лицами на нашей планете 4 и важным во всех средах 5, до сих пор не показал через аналогичные подходы. Здесь мы опишем подход для выделения и характеризующие геномы одного вирионов называется "Единое геномики Вирус" (SVG). SVG использует проточной цитометрии выделить индивидуальные вирусы и весь амплификации генома для получения высокого молекулярного веса геномной ДНК (гДНК), который может быть использован в последующих реакциях секвенирования.
Protocol
1. Подготовка вирусных суспензий
Перед выделением одного вирионы с помощью проточной цитометрии, готовят незаписанных вирусных суспензий.
- Изолировать вирусных частиц с использованием ранее установленных протоколов убедившись, что окончательное вирусной суспензии содержится в 0,1 мкм фильтруется TE (Трис-ЭДТА, рН 8). Мы рекомендуем использовать тангенциальной фильтрации потока (TFF) приближается к 6, хотя другие были разработаны методы, которые используют химические флокуляции 7.
- Перечислить вирусных частиц с использованием установленных протоколов, например, с помощью эпифлуоресцентной 8-10 или проточной цитометрии 11,12.
- Аликвоты суспензии вируса в две пробирки Эппендорфа (конечный объем рекомендуется, чтобы 1000 мкл).
2. Проточной цитометрии
- Для сортировки вирусы с помощью BD FACSAria II потока Цитометр оснащен пользовательские Вперед PMT рассеяния (FSC ФЭУ), разбавленные вирусных частиц в 0,1 мкм фильтруется TE, рН 8.0 на соответствующий титр для события размере 200 событий с -1.
- Установите пороговые значения максимального отношения сигнал-шум пайки, например. для смешанной сборки содержащих T4 и лямбда-частицы фага рекомендуется следующее: FSC PMT в 1000 и SSC при 200.
- Выполнить 100 мкл "пустой" образцы, содержащие только 1) 0,1 мкм фильтруется TE и 2) 0,1 мкм-TE и фильтруется SybrGreen1 на 1E-4 разбавления акций (10 000 X).
- Выполнить небольшую аликвоту (100 мкл рекомендуется) неокрашенных вирусной суспензии для оценки фона, а затем окрашенных вирусной суспензии (SybrGreen1 в 1e-4 разбавление акций), вирусные частицы, в общей сложности до 5000 событий в каждой. Это проверить концентрацию и регулировать сортировка ворота, если необходимо, до сортировки. Мы рекомендуем плотный ворот в центре вирусных частиц. Кроме того, для генерации ворот мы используем SYBR Green и FSC PMT сюжет.
- Добавляют 5 мкл 1% низкой температурой плавления (LMP) агарозы (в буфере ТВЕ), охлажденному до 37 ° С для каждогоа на политетрафторэтилена (ПТФЭ) стекло микроскопа (наук электронная микроскопия).
- Загрузите слайд ПТФЭ микроскопа в проточном цитометре для захвата отсортированный вирусных частиц.
- Начать рода SYBR зеленый окрашенные вирусных частиц непосредственно на слайд с PTFE LMP агарозы. Мы рекомендуем сортировка 10 или более событий (вирусные частицы), в некоторых скважинах для помощи в обнаружении глубину вирусов при конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CSLM).
- При сортировке завершена, удалить слайд из проточного цитометра и добавляют 5 мкл более LMP агарозном охлаждают до 37 ° С в каждую лунку, что встраивание вирусной частицы (ов).
3. Визуализация Одноместный вирионы с помощью конфокальной микроскопии
Если один вирион желательно, то определения того, каждая лунка содержит отдельные вируса необходимо и CLSM необходимо визуализировать встроенный вириона (ы) в 3D, чтобы убедиться, что только одной частице присутствует и что несколько вирусовне накладываются на друг друга.
- Установка лазерного микроскопа с длиной волны 488 нм возбуждение.
- Изображение встроенных вирусных частиц с использованием 63X большим рабочим расстоянием цели.
4. Всего Усиление Геном
- После скважин с одной вирусы идентифицируются с КЛСМ выполнения целого генома усиления использованием нескольких усиления смещения (MDA) в агарозы (на месте).
- Чтобы уменьшить вероятность введения ДНК загрязнения, удалите нужную 'бисер' агарозном из слайда и помещают в стерильную пробирку PCR. Использование пары стерильных пинцетов и / или лезвие для этого шага.
- Лизируйте вирусных частиц на месте с использованием тепла (94 ° C) в течение 3 мин в тепло блок Термоциклер.
- Выполните следующие рекомендации MDA реакции производителя (GenomiPhi HY комплект, GE Healthcare) со следующими изменениями
- Сократить объем образца и буфера реакцииFERS до 11,25 мкл и инкубировали при 30 ° С в течение не более 2 ч, чтобы уменьшить неспецифическую амплификацию.
- Очищают амплифицированных геномных материалов путем передачи геномной ДНК (гДНК) в 1,7 мл пробирку Эппендорфа и добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия (ацетат натрия) в буфере TBE (же буфер, используемый в подготовке LMP агарозном).
- Место пример (ы) при 55 ° С в течение 10 мин, чтобы растворить агарозы.
- Перемещение трубки (ы) до 42 ° С, чтобы уменьшить температуру перед добавлением фермента.
- Добавить 2 единицы β-агаразы в каждую пробирку и инкубировали в течение 2 часов.
- Добавить 1 объем буфера насыщенного раствора фенола к трубке, смешайте энергично и центрифугируют при 3500 х г в течение 15 мин. Передача супернатант, содержащий ДНК в новую 1,7 мл пробирку Эппендорфа.
- Добавить одном объеме 100% изопропанола и 1 мкл Glycoblue. Хорошо перемешать путем обращения трубки.
- Центрифуга при 28000 х г при 4 ° С в течение 60 мин. Слейте изопропанол следя, чтобы не беспокоить гранул. Добавить 150 мкл 70% этанольннол в каждую пробирку. Спиновые на 28 000 XG КТ в течение 10 мин. Декантировать этанол, воздух сухой осадок ДНК и ДНК ресуспендируют в соответствующем объеме буфера ТЕ.
- Мы рекомендуем повторяя шаги 4.4-4.9 со следующими изменениями. Установка 3-5 повторных реакций МДА и уменьшить инкубации при 30 ° С до 1 часа. Бассейн образцов после очистки и осадок использованием 95-100% этанола с получением желаемой концентрации.
5. Представитель Результаты
1 приведена SVG процесса. Эти методы используют проточной цитометрии для сортировки вирусных частиц ПТФЭ на предметные стекла микроскопа содержащих агарозу, чтобы изолировать одну вирионов из смешанного сборка последующим MDA для получения количества гДНК, которые являются достаточными для секвенирования.
В качестве доказательства правильности концепции, бактериофаг лямбда и Т4 смешивают и подвергают процессу SVG 11. Как только вирионы были захвачены и встроенные в агарозном, CLSM васек использоваться для визуализации и подтверждения того, что один вирион был получен;. Результаты показаны на рисунке 2 После скважин с одной вирионов были определены, они были выбраны для MDA гДНК. Затем мы использовали мультиплексной ПЦР для конкретных T4 и лямбда определить вириона изолированы, рисунок 3. Изолированным фага лямбда был выбран для секвенирования генома.
Секвенирование генома проводили с использованием 454-титан технологии и последовательности чтения подвергались ссылки отображения для определения уровня покрытия, полученные с использованием SVG. 4 видно, что почти весь геном лямбда был восстановлен (за исключением первых 5 пар оснований).
Рисунок 1. SVG методологии. Вирусные суспензии, содержащие смешанные сборки сводятся к одной вирусных частиц с помощью проточной цитометрии, которые затем секorted на отдельные агарозном "Бусы". Вирус встроен в агарозном шарик путем наложения с дополнительным слоем агарозы сообщение проточной цитометрии сортировки. Наконец, весь геном усиление осуществляется на месте.
Рисунок 2. Конфокальной лазерной сканирующей микрофотография отсортированный вирусной частицы встроенных в агарозном шарик.) Трехмерная реконструкция Sybr Green I окрашенных вирусной частицы в агарозном шарик. Врезка: большем увеличении выделенной вирусной частице B) профиль участка относительной флуоресценции окрашенных одной вирусной частицы в агарозном шарик..
Рисунок 3. Бактериофаги идентификации с использованием ПЦР.) </ STRONG> Мультиплекс ПЦР с использованием T4 и лямбда-специфические праймеры к генотипу, переулки: 1. Trackit 1 кб плюс лестница (Invitrogen), 2. Лямбда интегразу (750 б.п.), 3. T4 основных белок капсида (1050 б.п.), 4. . Mix лямбда интегразу и Т4 основной белок капсида B) Последующие лямбда-специфической ПЦР с дополнительным локусам Для дальнейшего подтверждения генома фага изоляции, переулки: 1. Лямбда интегразу (750 б.п.), 2. Лямбда репрессор (356 б.п.) 3. Лямбда Sie (суперинфекция исключения) (456 б.п.) 4. Trackit 1 кб плюс лестница (Invitrogen).
Рисунок 4. Лямбда геном атрибуты и покрытия.) GC участок, B) Геном карту лямбда (адаптировано из http://img.jgi.doe.gov ) и С) Картирование SVG считывает с опорным бактериофага лямбда, ось х Геном позиции, Я.Xis является% покрытия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ряд важных факторов, должны быть приняты во внимание при применении SVG подходов. Генотипирования, как мы делали во время проверка концепции эксперимента 13, не является допустимым вариантом для экологического или неизвестных изолятов консервативных праймеров не доступны во всех вирусных групп. Кроме того, фон синтеза ДНК или неспецифического усиления обычно сообщают в процессе амплификации с использованием реакции MDA 14. Неспецифический усиления был приписан к загрязнению ДНК выходит из реакции реагенты и / или через механизм, который дает возможность усиления от случайных гексамеров в реакционной смеси. При работе с вирусными комплексы, то, возможно, более высокую вероятность неспецифических ДНК преимущественно усиливается благодаря более низкому количеству шаблон вирусной ДНК в отличие от одной бактериальной клетки в результате значительных различий в частицы (клетки) размер и содержание геномной ДНК ( 25-100 нм; ~ 1,5 FG на присутствие вирусов иотличие от 0,2-1,5 мкм; ~ 14 FG для бактерий). Следующие методы рекомендуются для снижения уровня неспецифической амплификации: лечение вирусных комплексов с ДНКаза I, экспертиза, содержащих вирус агарозы использованием КЛСМ сокращение времени инкубации MDA и увеличить глубину последовательности (т.е. как способна со следующим поколением технологии секвенирования как 454-Титан и Illumina).
При выполнении SVG на пробах окружающей среды, оптимизированные De Novo сборки необходимо получить полную или почти полную последовательность генома. Мы обнаружили, что снижение избыточного считывает перед сборкой необходимо получить более широкий охват 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Кена Nealson за его понимание и консультации на протяжении всего процесса подготовки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
