Summary
Genómica de virus individuales (SVG) es un método para aislar y amplificar los genomas de los viriones individuales. Suspensiones virales de un conjunto mixto se ordenan mediante citometría de flujo en un portaobjetos de microscopio con pozos discretas que contienen agarosa, capturando así el virión y la reducción del genoma cizallamiento durante el procesado posterior. Amplificación del genoma completo se logra mediante la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) resultante en el material genómico que es adecuado para la secuenciación.
Abstract
Amplificación del genoma entero y secuenciación de las células microbianas individuales permite la caracterización genómica y sin la necesidad de cultivo de 1-3. Los virus, que son muy abundantes y las más numerosas entidades en nuestro planeta 4 e importante en todos los ambientes, 5 aún no se han puesto de manifiesto a través de enfoques similares. A continuación se describe un método para el aislamiento y la caracterización de los genomas de los viriones single llamado "Genómica Virus única» (SVG). SVG utiliza citometría de flujo para aislar los virus individuales y de todo el genoma de amplificación para obtener ADN genómico de alto peso molecular (gDNA) que se puede utilizar en reacciones de secuenciación posteriores.
Protocol
1. Preparación de suspensiones virales
Antes de aislamiento de viriones individuales a través de citometría de flujo, preparar suspensiones virales no fijadas.
- Aislar partículas virales mediante protocolos previamente establecidos que hacen suspensión viral definitiva que figura en 0.1 micras con filtro TE (Tris-EDTA, pH 8). Se recomienda el uso de filtración de flujo tangencial (TFF) se aproxima a 6 aunque otros métodos han sido desarrollados para el uso de químicos de floculación 7.
- Enumerar las partículas virales mediante protocolos establecidos, por ejemplo, utilizando 8-10 epifluorescencia o citometría de flujo de 11,12.
- Alícuota de suspensión viral en dos tubos Eppendorf (volumen final se recomienda tener 1.000 l).
2. Citometría de Flujo
- Para clasificar los virus utilizando el BD FACSAria II citómetro de flujo equipado con un PMT dispersión frontal personalizado (FSC PMT), diluir las partículas virales en 0,1 micras de filtración TE, pH 8.0 a un título apropiado para una tasa de eventos de 200 eventos seg -1.
- Establecer umbrales para maximizar raciones señal-ruido, por ejemplo. para un conjunto mixto que contiene partículas de fago T4 y lambda se recomiendan las siguientes: FSC PMT en 1000 y SSC a 200.
- Ejecutar 100 l de muestras "en blanco" que sólo contienen 1) 0,1 micras TE-filtrada, y 2) 0,1 micras TE-filtrada y SybrGreen1 a 1e-4 dilución del stock (10.000 X).
- Ejecutar una pequeña alícuota (se recomienda 100 l) de la suspensión viral sin teñir para evaluar fondo, seguido de la suspensión viral manchada (SybrGreen1 a 1e-4 dilución de stock), las partículas virales a un total de 5.000 eventos cada uno. Esto es para comprobar y ajustar la concentración de puertas de clasificación, si es necesario, antes de la especie. Recomendamos una puerta estrecha en el centro de las partículas virales. Además, para la generación de puertas usamos el SYBR Green y FSC PMT trama.
- Añadir 5 l de 1% bajo punto de fusión (LMP) de agarosa (en tampón TBE) se enfrió a 37 ° C a cada unobien en un politetrafluoroetileno (PTFE) portaobjetos de microscopio (Electron Microscopy Sciences).
- Coloque el portaobjetos de PTFE en el citómetro de flujo para capturar las partículas virales clasificadas.
- Comience tipo de partículas virales manchadas SYBR verde directamente en PTFE diapositivas con LMP agarosa. Se recomienda clasificación 10 o más eventos (partículas virales) en algunos pozos para ayudar en la detección de la profundidad de los virus durante la microscopía láser confocal de barrido (CSLM).
- Al ordenar, retire diapositiva del citómetro de flujo y añadir 5 l más LMP agarosa enfriada a 37 º C a cada pocillo, incorporar tanto la partícula viral (s).
3. Visualizar viriones individuales mediante microscopía confocal
Si se desea un solo virión, a continuación, determinar si cada pocillo contiene un virus individual es imperativo y CLSM es necesario visualizar el virión incorporado (s) en 3D para verificar que sólo una sola partícula está presente y que múltiples virusno se apilan en la parte superior de uno al otro.
- Ajuste el microscopio láser a la longitud de onda de 488 nm de excitación.
- Imagen de las partículas virales integrados utilizando un objetivo de larga distancia de trabajo 63X.
4. Amplificación del genoma entero
- Una vez los pocillos con virus individuales se identifican con CLSM, lleve a cabo la amplificación del genoma entero utilizando amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) dentro de la agarosa (in situ).
- Para disminuir la probabilidad de introducir contaminación de ADN, eliminar las 'bolas' deseadas de agarosa de la corredera y se coloca en un tubo de PCR estéril. Use un par de pinzas estériles y / o hoja de afeitar para este paso.
- Lyse la partícula viral in situ utilizando el calor (94 ° C) durante 3 min en el bloque de calor de un termociclador.
- Realizar recomendaciones la siguiente reacción MDA del fabricante (kit GenomiPhi HY, GE Healthcare) con las siguientes modificaciones
- Reducir el volumen de la muestra y la reacción bufcias a 11,25 l y se incuba a 30 ° C durante un máximo de 2 horas para reducir la amplificación no específica.
- Se purifica el material genómico amplificado mediante la transferencia de ADN genómico (gDNA) a un tubo Eppendorf de 1,7 ml y añadir 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M (NaOAc) en tampón TBE (mismo tampón utilizado en la preparación de agarosa LMP).
- Colocar la muestra (s) a 55 ° C durante 10 min para disolver agarosa.
- Mueva tubo (s) a 42 ° C para reducir la temperatura antes de la adición de enzima.
- Añadir 2 unidades de β-agarasa a cada tubo y se incuba durante 2 hr.
- Añadir 1 volumen de una solución de fenol saturado con tampón al tubo, mezclar vigorosamente y se centrifuga a 3500 xg durante 15 min. Transferencia de ADN que contiene sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf de 1,7 ml.
- Añadir un volumen de 100% de isopropanol y 1μl de Glycoblue. Mezclar bien por inversión del tubo.
- Centrifugar a 28.000 xg a 4 ° C durante 60 min. Decantar isopropanol asegurándose de no perturbar el sedimento. Añadir 150 l de 70% ethanol a cada tubo. Girar a 28.000 xg y RT durante 10 min. Decantar el etanol, secar al aire el sedimento de ADN y resuspender el ADN en un volumen apropiado de tampón TE.
- Se recomienda repetir los pasos 4.4 a 4.9 con las siguientes modificaciones. Configurar 3-5 MDA reacciones en paralelo y reducir la incubación a 30 ° C y 1 hora. Piscina muestras después de la purificación y precipitado utilizando etanol 95-100% para obtener la concentración deseada.
5. Los resultados representativos
La figura 1 resume el proceso de SVG. Estos métodos utilizan citometría de flujo para clasificar partículas virales en portaobjetos de microscopio de PTFE que contienen agarosa para aislar viriones individuales a partir de un conjunto mezclado seguido por la MDA para obtener cantidades de gDNA que son suficientes para la secuenciación.
Como prueba de concepto, bacteriófago lambda y T4 se mezclaron y se sometieron al proceso de SVG 11. Una vez viriones fueron capturados y embebidas en agarosa, CLSM was utiliza para visualizar y confirmar que se obtuvo un único virión;. resultados se muestran en la Figura 2 Una vez que se identificaron los pocillos con viriones individuales, que se seleccionaron para la MDA de ADNg. A continuación, utiliza PCR multiplex específico para T4 y lambda para identificar el virión aislado, Figura 3. Un aislado de fago lambda fue seleccionado para la secuenciación del genoma.
La secuenciación del genoma se llevó a cabo utilizando la tecnología de 454-titanio y lecturas de secuenciación fueron sometidos a mapeo de referencia para identificar el nivel de cobertura obtenido usando SVG. Figura 4 muestra que se recuperó casi todo el genoma lambda (con la excepción de los primeros 5 pb).
Figura 1. SVG metodología. Suspensiones virales que contienen un conjunto mixto se reducen a partículas virales individuales a través de citometría de flujo que luego sorted en individuales agarosa "cuentas". El virus está incrustado dentro de la perla de agarosa mediante la superposición con una capa adicional de clasificación de citometría de flujo después de agarosa. Por último, todo el genoma de amplificación se lleva a cabo in situ.
Figura 2. Micrografía de una partícula viral ordenados incrustado en una perla de agarosa de escaneo láser confocal. A) Reconstrucción tridimensional de una partícula viral Verde I-manchado Sybr dentro de una perla de agarosa. Recuadro: un aumento mayor de la partícula viral aislado B) Perfil parcela de fluorescencia relativa de la partícula viral única manchada dentro de un cordón de agarosa..
Figura 3. Bacteriófago identificación mediante PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR utilizando primers T4 y lambda-específico para el genotipo, Lanes: 1. TrackIt 1 kb plus escalera (Invitrogen), 2. lambda integrasa (750 pb), 3. Proteína principal de la cápside de T4 (1.050 pb), 4. . Mezcla de lambda integrasa y la principal proteína de la cápside T4 B) Tras lambda específico PCR con loci adicionales para confirmar aún más fago genoma aislamiento, Lanes: 1. Lambda integrasa (750 pb), 2. Represor lambda (356 pb) 3. Lambda sie (exclusión superinfección) (456 pb) 4. TrackIt 1 kb plus escalera (Invitrogen).
La Figura 4. Lambda atributos del genoma y la cobertura. A) GC trama, B) del mapa del genoma de lambda (adaptado de http://img.jgi.doe.gov ) y C) Asignación de SVG lee en el bacteriófago lambda referencia, eje x es posición del genoma, yaxis es% de cobertura.
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Discussion
Un número de factores importantes que hay que tener en cuenta a la hora de aplicar enfoques SVG. Genotipificación, como se lleva a cabo durante el experimento de prueba de concepto 13, no es una opción válida para aislamientos ambientales o desconocidos como cebadores conservados no están disponibles en todos los grupos virales. Además, el fondo síntesis de ADN o la amplificación no específica se ha divulgado durante la amplificación mediante la reacción de MDA 14. Amplificación no específica se ha atribuido a la contaminación de ADN que emerge de reactivos de reacción y / o a través de un mecanismo que permite la amplificación de los hexámeros al azar dentro de la mezcla de reacción. Cuando se trabaja con ensamblajes virales, hay quizá una mayor probabilidad de ADN amplificado preferentemente no específicos debido a la menor cantidad de plantilla de ADN viral en comparación con las células bacterianas individuales como resultado de la diferencia significativa en las partículas (células) tamaño y contenido de ADN genómico ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg en busca de virus, comodiferencia de 0,2-1,5 um; ~ 14 fg para las bacterias). Se recomiendan los siguientes métodos para reducir el nivel de la amplificación no específica: el tratamiento de los ensamblajes virales con DNasa I, el examen de virus que contiene perlas de agarosa utilizando CLSM, la reducción de MDA tiempo de incubación y el aumento de la profundidad de secuenciación (es decir, como es capaz, con las tecnologías de secuenciación de nueva generación como 454-titanio y Illumina).
Al realizar SVG en muestras ambientales, optimizado ensamblaje de novo es imprescindible para obtener la secuencia completa del genoma o casi completa. Hemos encontrado que la reducción de la redundancia lee antes del montaje es necesario para obtener una mayor cobertura 13.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Ken Nealson por su visión y asesoramiento durante todo el proceso de preparación de manuscritos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
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