Summary
السقسقة هو تقنية جديدة وسريعة لرسم خريطة الجينوم مواقع الربط من RNAs noncoding طويلة (lncRNAs). طريقة يستفيد من خصوصية [أليغنوكليوتيد] تبليط المضادة للمعنى للسماح للتعداد من المواقع الجينومية lncRNA محدد.
Abstract
RNAs وnoncoding الطويلة المنظمين الرئيسيين للدول لونين للعمليات البيولوجية الهامة مثل تعويض الجرعة، يطبع، والتنموية التعبير الجيني 1،2،3،4،5،6،7. الاكتشاف الأخير الآلاف من lncRNAs بالتعاون مع محددة مجمعات تعديل لونين، مثل مجمع القمعية Polycomb 2 (PRC2) التي تتوسط هيستون يسين H3 27 trimethylation (H3K27me3)، يشير إلى الأدوار واسعة للlncRNAs عديدة في إدارة الدول لونين في جينات محددة أزياء 8،9. في حين يعتقد بعض lncRNAs للعمل في رابطة الدول المستقلة على الجينات المجاورة، lncRNAs أخرى تعمل في العابرة لتنظيم الجينات على بعد. على سبيل المثال، ذبابة الفاكهة lncRNAs roX1 ومناطق ربط roX2 عديدة على الكروموزوم (اكس) من الخلايا الذكرية، وهي حيوية بالنسبة للتعويض جرعة 10،11. ومع ذلك، ليست معروفة على وجه التحديد المواقع من مواقعهم ملزم في ارتفاع القرار. وبالمثل، يمكن أن تؤثر على الإنسان lncRNA HOTAIR PRC2 الإشغال في حundreds من الجينات الوراثية على نطاق 3،12،13، ولكن كيف يتحقق التحديد غير واضحة. ويمكن أيضا أن تكون بمثابة LncRNAs السقالات وحدات لتوظيف جمعية مجمعات البروتين متعددة. الكلاسيكية عبر القائم بأعمال RNA سقالة هو الحمض النووي الريبي TERC التي هي بمثابة القالب وسقالة للتيلوميراز مجمع 14؛ HOTAIR يمكن أيضا أن تكون بمثابة سقالة لPRC2 وdemethylase H3K4 معقدة 13.
وكشفت دراسات سابقة رسم الإشغال في الحمض النووي الريبي لونين رؤى كبيرة 15،16، ولكن فقط في مكان جين واحد في وقت واحد. ليست معروفة في مواقع شغل معظم lncRNAs، وتم أدوار lncRNAs في تنظيم الكروماتين الاستدلال معظمها من الآثار غير المباشرة للاضطراب lncRNA. تماما كما لونين مناعي تليها ميكروأري أو تسلسل عميق (رقاقة رقاقة أو رقاقة وما يليها على التوالي) قد تحسنت بشكل كبير من فهمنا للبروتين تفاعلات الحمض النووي على نطاق الجينوم، ونحن هنا توضيح recenنشرت tly استراتيجية لرسم خريطة الحمض النووي الريبي طويل شغل الجينوم على نطاق بدقة عالية 17. ويستند هذا الأسلوب، عزل الكروماتين بواسطة تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة) (الشكل 1)، في القبض على تقارب من lncRNA الهدف: لونين من قبل مجمع بلاط العقاقير-oligos، الذي يولد ثم خريطة للمواقع الربط الجيني على قرار من قواعد عدة مئات مع حساسية عالية ومنخفضة في الخلفية. السقسقة ينطبق على العديد من lncRNAs لأن التصميم من الألفة، تحقيقات واضح ومباشر نظرا لتسلسل الحمض النووي الريبي ويتطلب أي معرفة بنية الحمض النووي الريبي أو المجالات الوظيفية.
Protocol
1. مسبار التصميم
تصميم المضادة للمعنى الحمض النووي تبليط تحقيقات لاسترجاع الانتقائي لهدف الجيش الملكي النيبالي بواسطة السقسقة.
- تحقيقات تصميم بنسبة ضئيلة المضادة للمعنى باستخدام مسبار مصمم على الانترنت في singlemoleculefish.com 18.
- استخدم هذه المعلمات: عدد من تحقيقات = 1 مسبار / 100 BP من طول الحمض النووي الريبي، 2)٪ GC الهدف = 45؛ طول تباعد 4) = 60-80، 3) طول نيوكليوتيدات دقيقة = 20. كسر الحمض النووي الريبي إلى قطاعات إذا وقتا طويلا للمصمم. حذف مناطق من تكرار أو تماثل واسعة النطاق.
- تحقيقات ترتيب الحمض النووي لمكافحة الشعور مع BiotinTEG في 3-الوزراء نهاية.
- تحقيقات التسمية وفقا لمواقعهم على طول الحمض النووي الريبي. تفصل بينهما إلى حوضين بحيث "حتى" تجمع يحتوي على كافة التحقيقات ترقيم 2، 4، 6، وما إلى ذلك، و "الغريب" تجمع يحتوي على تحقيقات الترقيم 1، 3، 5، وما إلى ذلك خفف مجموعة من المجسات إلى تركيز ميكرومتر 100 و مخزن عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- جميع التجارب هي التي يتعين القيام بها باستخدامكلا حمامات، التي تكون بمثابة الضوابط الداخلية لبعضهم البعض. وحقيقي الحمض النووي الريبي التي تعتمد على إشارة يكون حاضرا من كلا حمامات، بينما التحقيق الخاصة الضوضاء ستكون فريدة من نوعها لكل تجمع. هذا ينطبق على كل من السقسقة، qPCR والسقسقة وما يليها.
2. حصاد خلايا
جمع الخلايا التي سيتم استخدامها لتجربة السقسقة.
- زراعة خلايا في لوحات زراعة الأنسجة أو قوارير إلى confluency. مخزنة شطف مع الفوسفات المالحة (PBS) مرة واحدة ويعرض للتريبسين. سقى التربسين مع حجم> 2X من وسائل الإعلام، ماصة صعودا وهبوطا لإزاحة الخلايا وresuspend في تعليق خلية واحدة. نقل جميع وسائل الإعلام وخلايا معلق إلى 50 مل أنابيب الصقر. 20000000 الخلايا وعادة ما تكون كافية لعينة السقسقة واحد.
- تدور في الخلايا 800RCF لمدة 4 دقائق. وسائل الاعلام نضح والخلايا resuspend 40 مليون نسمة في 40 مل من برنامج تلفزيوني، والجمع بين الأنابيب إذا لزم الأمر. تدور في الخلايا 800RCF لمدة 4 دقائق. صب PBS، نضح بعناية في زاوية السائل المتبقي. 3. عبر ربط الخلايا وجمع بيليه خلية
- تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد غلوتارالدهيد 1٪ في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. تحضير 10 مل لكل 10 مليون خلية (0.4 مل الأسهم غلوتارالدهيد 25٪ + 9.6 مل PBS). يجب أن تستخدم غلوتارالدهيد الطازجة.
- اضغط على الجزء السفلي من أنابيب الصقر لطرد الكريات. Resuspend خلية بيليه في غلوتارالدهيد 1٪، بدءا من الحجم الصغير لتجنب قطع، ثم يصل الى أعلى حجم كامل. قلب لخلط. تشعبي ل10min في درجة حرارة الغرفة على شاكر نهاية إلى نهاية أو محور دوار.
- إخماد رد فعل عبر الربط مع حجم 1/10th من جليكاين M 1.25 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تدور في 2000RCF لمدة 5 دقائق. نضح طاف بيليه ويغسل مع 20 مل فترت PBS مرة واحدة، والغزل في 2000RCF لمدة 5 دقائق.
- نضح وresuspend ثashed، عبر ربط بيليه في برنامج تلفزيوني مع 1 مل المبردة بنسبة 20 مليون خلية. نقل كل مل لأنبوب إيبندورف وتدور في 2000RCF لمدة 3 دقائق في 4 جيم PBS إزالة أكبر قدر ممكن مع طرف ماصة بعناية.
- فلاش تجميد الكريات خلية في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
- ذوبان الجليد الكريات الخلايا المجمدة في درجة حرارة الغرفة. الاستفادة من الصعب طرد وتخلط بيليه الخلية. تدور باستمرار على بيليه في 2000RCF لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. استخدام حاد 10 ميكرولتر طرف ماصة لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية.
- على توازن الإلكترونية (دقيقة إلى 1mg) الفارغة كتلة أنبوب إيبندورف فارغ (أنابيب لنا وزن 1.060 غرام باستمرار للغاية). وزن كل بيليه وتسجيل وزنه. وقال كامل طبق 15 سم من خلايا هيلا crosslinked تزن عادة 100 ملغ.
- الملحق الواق تحلل (10X كتلة بيليه، على سبيل المثال 1 مل ل100mg) مع FRESح البروتياز المانع، وPMSF Superase في (انظر المرفق قائمة عازلة). تخلط جيدا.
- إضافة 10X الواق حجم تحلل تستكمل إلى كل أنبوب وresuspend لبيليه. لكريات صغيرة <25 ملغ، resuspend في 250 ميكروليتر العازلة تحلل تستكمل. وينبغي أن يكون التعليق على نحو سلس. إذا لم يكن كذلك، تقسيم تعليق إلى 500 aliquots ميكرولتر واستخدام بيليه بمحركات خلاط لتفتيت كتل. الشروع فورا في صوتنة.
- يصوتن المحللة في الخلية Bioruptor في 15 مل من أنابيب الصقر. استخدم <المحللة 1.5 مل في كل أنبوب، وأسرع صوتنة، يصوتن لا يزيد عن اثنين من أنابيب في المرة الواحدة.
- يصوتن في حمام ماء درجة 4 مئوية في أعلى الإعداد مع 30 ثانية على، 45 ثانية عن فترات النبض. تحقق المحللة كل 30 دقيقة. تواصل sonicating حتى لم يعد عكر والمحللة الخلية. هذا قد يستغرق اقل من 30 دقيقة وساعة ما يصل الى 4. عددمن الأنابيب، فإن حجم العينة، ودرجة الحرارة حمام، والفترة الزمنية صوتنة تؤثر كم من الوقت تستغرق العملية. وسوف يصوتن أنابيب المرجح بمعدلات مختلفة، وذلك بتجميع بعضهم البعض، كل 30 دقيقة وإعادة توزيعه في أنابيب الأصلي لضمان تجانس. ملاحظة: غلوتارالدهيد-crosslinked الخلايا تأخذ فترة أطول كثيرا إلى يصوتن من حكمه الفورمالديهايد.
- عندما يتحول المحللة واضح، ونقل 5 المحللة ميكرولتر إلى أنبوب إيبندورف الطازجة. إضافة 90 البروتياز الحمض النووي ميكرولتر K (PK) العازلة (انظر قائمة العازلة) و 5 PK ميكرولتر. دوامة لخلط وتدور باستمرار لفترة وجيزة. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
- استخراج الحمض النووي مع عدة QIAGEN تنقية PCR. أزل الحمض النووي في 30 ميكرولتر الواق شطف QIAGEN (EB) والتحقق من حجم الحمض النووي على 1٪ الاغاروز هلام. إذا الجزء الأكبر من تشويه الحمض النووي هو 100-500 شركة بريتيش بتروليوم، صوتنة كاملة. إذا لم يكن كذلك، يواصل يصوتن.
- منبذة عينات sonicated في 16100RCF لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. الجمع بين supernatants، قسامة على 1 عينات مل وفلاش التجميد في سائل nitrogeن. متجر في -80 درجة مئوية.
- أنابيب ذوبان من لونين في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الواق التهجين (انظر قائمة العازلة، وإعداد 2 مل لكل مل من لونين). دوامة لخلط.
- لعينة نموذجية باستخدام السقسقة 1 مل من المحللة، وإزالة 10 ميكرولتر لINPUT الحمض النووي الريبي وميكرولتر 10 لINPUT الحمض النووي وتجري في أنابيب إيبندورف. تبقي على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى.
- نقل 1 مل لونين الى 15 مل أنبوب الصقر. إضافة 2 الواق التهجين مل إلى كل أنبوب. لإجمالي حجم <1.5 مل، واستخدام أنابيب إيبندورف.
- ذوبان الجليد تحقيقات في درجة حرارة الغرفة. (ينبغي أن تحقيقات ميكرومتر 100 المواصفات ~ 500-600 نانوغرام / ميكروليتر باستخدام الحمض النووي واحد وضع حبلا) Nanodrop تحقيقات للتأكد من المبلغ إذا لم تكن قد استخدمت منذ فترة طويلة. إضافة حجم مناسب من تحقيقات لأنابيب محددة (100 بمول التحقيق في لونين 1 مل، 1 ميكرولتر من تحقيق بمول / ميكرولتر 100 في لونين مل 1).تخلط جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع اهتزاز.
- مع 20 دقيقة المتبقية لتهجين، وإعداد حبات C-1 المغناطيسي (المخزنة في درجة مئوية 4). استخدام 100 ميكرولتر لكل 100 بمول من تحقيقات. تغسل مع 1 مل الواق تحلل unsupplemented ثلاث مرات، وذلك باستخدام شريط مغناطيس DynaMag-2 إلى حبات منفصلة عن العازلة.
- Resuspend الخرز في حجم الأصلي للتحلل العازلة؛ الملحق مع PMSF الطازجة، PI وSuperase في. بعد 4 رد فعل تهجين ساعة كاملة، إضافة 100 الخرز ميكرولتر إلى كل أنبوب. تخلط جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز.
- يعد غسل العازلة (5 مل لكل عينة). دوامة لخلط. قبل دافئ إلى 37 درجة مئوية. إضافة PMSF قبل الاستخدام.
- تغسل حبات مع 1 العازلة غسيل مل خمس مرات. على غسل الأولى، استخدم DynaMag-15 الشريط المغناطيسي إلى حبات منفصلة، صب، وresuspend في 1 مل العازلة غسيل. نقل الصوت إلى 1.5 مل أنبوب إيبندورف. احتضان في 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 5 دقائق.
- على غسيل لاحقة، وتدور باستمرار كل أنبوب على minicentrifuge، وضع العينة على DynaMag 2-الشريط المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. عينة صب، مسح أي يقطر مع Kimwipe، resuspend في 1 العازلة غسيل مل. احتضان في 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 5 دقائق. كرر لمدة خمسة يغسل الكلي.
- في غسل الماضي، resuspend حبات جيدا. إزالة 100 ميكروليتر وتوضع جانبا لعزل الحمض النووي الريبي. احتياطي 900 ميكروليتر لجزء من الحمض النووي. وضع جميع الأنابيب في قطاع-2 DynaMag المغناطيسي وإزالة العازلة غسيل. تدور جميع أنابيب أسفل لفترة وجيزة؛ وضعها على شريط مغناطيس. إزالة الجزء الأخير من المخزن يغسل تماما مع طرف حاد 10 ماصة ميكرولتر.
- أخذ 100 عينة حبة ميكرولتر و 10 عينة الحمض النووي الريبي INPUT ميكرولتر. إضافة 85 ميكرولتر الواق PK RNA 7.0 درجة الحموضة إلى الجيش الملكي النيبالي الإدخال. Resuspend الخرز في 95 ميكرولتر RNA 7.0 PK درجة الحموضة عازلة. إضافة 5 K Proteinease ميكرولتر واحتضانها في 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع نهاية إلى نهاية اهتزاز.
- تدور لفترة وجيزة لأسفل جميع الأنابيب وغلي العينات لمدة 10 دقيقة على حرارة كتلة في 95 درجة مئوية.
- البرد العينات على الجليد، إضافة 500 ميكرولتر TRIzol، دوامة بنشاط لمدة 10 ثانية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. متجر في -80 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 4.
- أضف 100 ميكروليتر إلى الكلوروفورم TRIzol عينات المعالجة. دوامة بنشاط لمدة 10 ثانية. تدور في 16100RCF على الطرد المركزي الفوق لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- إزالة ~ 400 طاف مائي ميكرولتر، وتجنب العضوية واجهة.
- إضافة 600 ميليلتر (1.5 وحدة التخزين) من الإيثانول بنسبة 100٪ وتخلط جيدا. تدور عينة من خلال أعمدة صغيرة MIRNeasy. غسل 1X مع RWT (MIRNeasy صغيرة عدة)، 2X مع RPE في بروتوكول الشركة المصنعة. أزل مع 30 ميكرولتر nuclease خالية من O 2 H (بيت التمويل الوطني 2 O).
- علاج شطافة RNA مع الحمض النووي خالية في بروتوكول الشركة المصنعة. بعد رد فعل كاملة، تسخين العينة لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية إلى تعطيل تماما أي الدناز المتبقية.
- استخدم 1 الحمض النووي الريبي لكل ميكرولتر عزل جيد للqRT-PCR تحليل لتأكيد lncRNAاسترجاع. وكثيرا ما يستخدم كعنصر تحكم GAPDH سلبي.
- تحضير الحمض النووي الواق شطف (انظر قائمة العازلة)، 150 ميكروليتر لكل عينة، بما في ذلك مساهمة الحمض النووي.
- إضافة 1 0μL ريبونوكلياز A (10 ملغ / مل) و 10 ميكرولتر H ريبونوكلياز (10 U / ميكرولتر) لكل مل من الاحتياطي شطف الحمض النووي، ودوامة لخلط.
- Resuspend كل عينة من الخرز في 150 ميكرولتر من العازلة شطف الحمض النووي مع RNases. (Resuspend INPUT الحمض النووي في 140 ميكرولتر) في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز.
- منفصلة الخرز وطاف على DynaMag 2-الشريط المغناطيسي. إزالة طاف وإضافة إلى أنابيب المسمى.
- إعداد قسامة الثانية من الاحتياطي شطف الحمض النووي مع 10 ألف ريبونوكلياز ميكروليتر (10 ملغ / مل) وRNaseH (10 U / ميكرولتر) تماما كما فعلت في 8.2). إضافة 150 ميكروليتر إلى كل عينة (بما في ذلك مدخلات DNA)، احتضان، وإزالة طاف. جمع كل طاف (شولد يكون ~ 300 ميكرولتر).
- إضافة 15 PK ميكرولتر إلى كل عينة. احتضان في 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز.
- قبل تدور باستمرار الأصفر أنابيب هلام مرحلة القفل (5PRIME). نقل عينات من الحمض النووي لأنابيب هلام مرحلة القفل، وإضافة 300 PhOH ميكرولتر: الكلوروفورم: أيزو أميلي لكل عينة. هزة بقوة لمدة 10 دقيقة، وتدور باستمرار على أجهزة الطرد المركزي في الفوق 16100RCF لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. أخذ مائي من أعلى (~ 300 ميكرولتر). إضافة 3 GlycoBlue ميكرولتر، 30 NaOAc ميكرولتر، و 900 ميكرولتر EtOH 100٪. تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية خلال الليل.
- تدور في عينات 16100RCF لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- صب طاف بعناية. إضافة 1 مل EtOH 70٪ ودوامة لخلط. تدور في 16100RCF لمدة 5 دقائق. إزالة طاف بواسطة ماصة. الهواء الجاف ل1min. Resuspend في 30 EB ميكرولتر.
- عينات من الحمض النووي على استعداد لتحليلها من قبل qPCR أو إعداد مكتبات التسلسل عالية الإنتاجية في بروتوكول البورشيد.
جمع الخلايا تشعبي مع غلوتارالدهيد للحفاظ على الحمض النووي الريبي، الكروماتين التفاعلات وإعداد خلية بيليه.
4. انحلال الخلايا
ليز الخلايا crosslinked لإعداد المحللة الخلية.
5. صوتنة
قص الحامض النووي من قبل sonicating lysates خلية crosslinked.
6. السقسقة
هجن تحقيقات الحمض النووي RNA والمعقدة البيروكسيديز إلى عزل لونين منضم.
7. الحمض النووي الريبي العزلة
استخراج الحمض النووي الريبي جزء من عينات السقسقة إلى quantitate بواسطة qRT-PCR.
8. الحمض النووي العزلة
استخراج جزء من الحمض النووي من عينات لتحديد السقسقة بواسطة التسلسل أو quantitate بواسطة qPCR.
10. ممثل النتائج
الشكل 1 ويبين الشكل 2 تخصيب اليورانيوم من الحمض النووي الريبي التيلوميراز الإنسان (TERC) من خلال خلايا هيلا GAPDH، والحمض النووي الريبي وفيرة الخلوية التي هي بمثابة الشاهد السلبي. وتم سحب غالبية من RNAs TERC (~ 88٪) موجودة في الخلية إلى أسفل عن طريق أداء السقسقة، في حين تم استرداد فقط 0.46٪ من الحمض النووي الريبي GAPDH، مما يدل على عامل إثراء أضعاف 200 ~. ويمكن استخدام مجسات مثل المجسات غير محددة تستهدف LacZ الجيش الملكي النيبالي، الذي لم يتم وأعرب في خلايا الثدييات (الشكل 2)، وضوابط سلبية إضافية.
وعادة ما يتم إثراء مناطق الحمض النووي من المتوقع أن تربط lncRNA الهدف على مناطق سلبية عندما تقاس qPCR. ويبين الشكل 3 qPCR التحقق من المواقع HOTAIR متجهة الى أربعة في الابتدائي الليفية القلفة البشرية التي نحن مصممون عن طريق أداء السقسقة، وما يليها في خط الخلية نفسها، في حين TERC وGAPDH الحمض النووي ذاته المواقعكما RVE مناطق سيطرة سلبية. على حد سواء "حتى" و "الغريب" مسبار يحدد تخصيب مقارنة أثمرت مواقع HOTAIR متجهة المتوقع على المناطق السلبية، وهي السمة المميزة للمواقع lncRNA ملزم صحيح.
عالية الإنتاجية تسلسل الحمض النووي المخصب السقسقة تعطي الخريطة العالمية من lncRNA ملزم المواقع. ومن المعروف أن lncRNA ذبابة الفاكهة roX2 للتفاعل مع كروموسوم X بطريقة ما هو مطلوب للحصول على تعويض جرعة. ويبين الشكل 4 roX2 الشخصي ملزم أكثر من جزء من الكروموزوم (اكس). وقد تم التسلسل كل من "حتى" و "الغريب" العينات ولقد تم القضاء على الضوضاء فريدة من نوعها لانتاج مسار الاشارات المتداخلة. كل "الذروة" يشير هنا في موقع قوي من roX2 ملزم. وقد وصفت المسار الكامل وقائمة من الجينات المستهدفة في roX2 تشو وآخرون 2011 17.
الرسم البياني رقم 1 التدفق. من اإلجراءات السقسقةdure. وcrosslinked لونين إلى lncRNA: adducts البروتين في الجسم الحي المعقدة البيروكسيديز تحقيقات التبليط وتهجين لاستهداف lncRNA، ويتم تنقيته مجمعات لونين باستخدام الخرز streptavidin المغناطيسي، تليها يغسل صرامة. نحن أزل lncRNA الحمض النووي أو البروتينات المربوطة مع مزيج من ألف ريبونوكلياز وحاء وschematized تسلسل lncRNA المفترضة ملزم في البرتقال. نشرت سابقا في تشو وآخرون 2011 (17).
الشكل 2. يثري السقسقة عن الحمض النووي الريبي TERC الإنسان. TERC-asDNA تحقيقات استرداد ~ 88٪ من الحمض النووي الريبي والخلوية TERC GAPDH لا يمكن الكشف عنها. وتستخدم LacZ-asDNA تحقيقات وضوابط السلبية واسترجاع لا الرنا. يعني + وتظهر SD. نشرت سابقا في تشو وآخرون 2011 (17).
الشكل 3. HOTAIR السقسقة-qPCR في الإنسان الأساسية عنالليفية eskin. NFKBIA، HOXD3-4، وSERINC5 ABCA2 هي المناطق التي تتفاعل مع HOTAIR. خدم TERC وGAPDH كما الضوابط السلبية. يعني + وتظهر SD. نشرت سابقا في تشو وآخرون 2011 (17).
الشكل 4. السقسقة، وما يليها من بيانات الحمض النووي الريبي roX2 في خلايا ذبابة الفاكهة SL2. وتسلسلها واضاف "حتى" و "الغريب" على حدة، والبيانات الخاصة بهم دمج لتعكس قمم المشترك الوحيد في كلا. ويظهر المسار المدمج. نشرت سابقا في تشو وآخرون 2011 (17).
Discussion
وصفها هنا نحن السقسقة، وما يليها، وسيلة لرسم الخرائط في مواقع lncRNA فيفو ملزم الجينوم على نطاق. المعلمات الرئيسية للنجاح هي حمامات انقسام تبليط تحقيقات نيوكليوتيدات دقيقة ويشابك غلوتارالدهيد. تصميم تقارب-تحقيقات واضح ومباشر نظرا لتسلسل الحمض النووي الريبي ويتطلب أي علم مسبق بنية الحمض النووي الريبي أو المجالات الوظيفية. نجاحنا مع roX2، TERC، وHOTAIR - ثلاثة RNAs ومختلفة الى حد ما في نوعين - تشير إلى أن السقسقة، وما يليها هو تعميم من المرجح أن lncRNAs كثيرة. كما هو الحال مع كل التجارب، ومطلوبة من الرعاية والضوابط المناسبة لتفسير النتائج. lncRNA مختلفة قد تتطلب المعايرة من الظروف، وتغير حكيمة من الشروط، مثل اختيار تحقيقات تقارب مختلفة أو قد crosslinkers، تسليط الضوء على جوانب مختلفة من الحمض النووي الريبي، لونين التفاعلات. مثل رقاقة وما يليها، وليس كل الأحداث وظيفية ملزم بالضرورة، وثمة حاجة إلى دراسات إضافية للتأكد من العواقب البيولوجية من الحمض النووي الريبي سccupancy على لونين. ومع ذلك، فإننا نتوقع طلبات كثيرة مثيرة للاهتمام لهذه التكنولوجيا للباحثين من lncRNAs الكروماتين الأخرى المرتبطة بها، التي يبلغ عددها الآن بالآلاف 8،9. تماما كما رقاقة وما يليها قد فتح الباب لالجينوم على نطاق الاستكشافات من الحمض النووي من البروتين التفاعلات، قد السقسقة، وما يليها من دراسات "interactome الحمض النووي الريبي" تكشف عن سبل جديدة العديد من الاحياء.
Disclosures
تتم تسمية جيم تشو وتشانغ HY كما المخترعين في طلب البراءة بناء على هذه الطريقة.
Acknowledgments
نشكر T. هونغ، MC. تساي، O. مانور، سيغال E.، كورودا م، Swigut ت، وأولا Shestopalov للمناقشات. بدعم من وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث في سنغافورة (CC)، المعاهد الوطنية للصحة R01-R01 و CA118750 HG004361-(HYC)، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (HYC). HYC هو عالم الوظيفي في وقت مبكر من معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer List: | |||
| Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 °C. | |||
| Lysis Buffer: | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 10 mM EDTA 1% SDS Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads |
|||
| Proteinase K Buffer (for DNA) | |||
| 100 mM NaCl 10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 1 mM EDTA 0.5% SDS Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use |
|||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl 1% SDS 50 mM Tris-Cl pH 7.0 1 mM EDTA 15% formamide (store in the dark at 4 °C) Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use |
|||
| Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 0.5% SDS Always add PMSF fresh before use |
|||
| DNA elution Buffer | |||
| 50 mM NaHCO3 1% SDS |
|||
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma-Aldrich | G5882-10x10ml | |
| Motorized pellet mixer | VWR international | V8185-904 | |
| Protease inhibitor | Roche Group | 11873580001 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Superase-in | Ambion | AM2696 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 | |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-25G | |
| DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
| Rnase H | Epicentre Biotechnologies | R0601K | |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 | |
| Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Glycine | JT Baker | 4057-06 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 | |
| Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| 10% SDS | Invitrogen | 15553-027 | |
| DNA-free | Ambion | AM1906 | |
| Buffer kit | Ambion | AM9010 | |
| Formamide | Invitrogen | 15515-026 | |
References
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).
- Rinn, J. L. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129, 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Kelley, R. L. Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin. Cell. 98, 513-522 (1999).
- Pandey, R. R. Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation. Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).
- Wang, K. C. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature. 472, 120-124 (2011).
- Khalil, A. M. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).
- Zhao, J. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).
- Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system. Cell. 88, 445-457 (1997).
- Franke, A., Baker, B. S. The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila. Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).
- Gupta, R. A. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature. 464, 1071-1076 (2010).
- Tsai, M. C. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science. 329, 689-693 (2010).
- Zappulla, D. C., Cech, T. R. RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).
- Nagano, T. The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin. Science. 322, 1717-1720 (2008).
- Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature. 32, 623-626 (2002).
- Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions. Mol. Cell. , (2011).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
