Summary
Neuromuscular बिजली उत्तेजना के एक murine मॉडल (NMES), पूर्वकाल कम्पार्टमेंट की मांसपेशियों के लिए एक सुरक्षित और सस्ती नैदानिक साधन, वर्णित है. इस मॉडल को चूहों में लक्षित और विशिष्ट मांसपेशी संकुचन को जानने के उद्देश्य के लिए आसानी से उपलब्ध नैदानिक डिवाइस को संशोधित करने का फायदा है.
Abstract
, Neuromuscular बिजली की उत्तेजना (NMES) एक आम नैदानिक साधन है कि व्यापक रूप से 1 को पुनर्स्थापित करने के लिए, 2 को बनाए रखने या 3-5 मांसपेशी कार्यात्मक क्षमता बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है है. कंकाल की मांसपेशी के transcutaneous सतह उत्तेजना एक कैथोड और एक anode के बीच एक वर्तमान प्रवाह है, जिससे मोटर इकाई और आसपास के मांसपेशी फाइबर की उत्तेजना उत्प्रेरण शामिल है.
NMES एक आकर्षक साधन के लिए कई कारणों के लिए कंकाल की मांसपेशी अनुकूली प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन है. सबसे पहले, यह एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक मॉडल में जो और मांसपेशियों को मजबूत बनाने के 6 myofiber hypertophy, angiogenesis को 7-9, 9-11 कारक वृद्धि स्राव, और मांसपेशी 12 अग्रदूत सेल सक्रियण के रूप में शारीरिक रूपांतरों, अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं प्रदान करता है. इस तरह के शारीरिक प्रतिक्रियाओं ध्यान से उत्तेजना के विभिन्न मानकों (Cochrane समीक्षा के लिए 13,) का उपयोग titrated हो सकता है. इसके अलावा, रंगरूटों NMESमोटर इकाइयों गैर चुनिंदा, और एक spatially तय की और अस्थायी तुल्यकालिक 14 तरीके में, सभी तंतुओं पर उपचार प्रभाव exerting के लाभ की पेशकश की, फाइबर प्रकार की परवाह किए बिना. हालांकि वहाँ परिधीय शिरापरक विकारों या दुष्टता सहित नैदानिक आबादी, के में NMES निर्दिष्ट मतभेद हैं, उदाहरण के लिए, NMES सुरक्षित और संभव है, जो बीमार और / या अपाहिज हैं और आबादी में जो कठोर व्यायाम चुनौतीपूर्ण हो सकता है के लिए भी.
यहाँ, हम अनुकूल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इलेक्ट्रोड और एक NMES प्रोटोकॉल एक murine मॉडल का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. इस पशु मॉडल में एक चिकित्सकीय उपलब्ध उपकरण के उपयोग और तत्काल प्रतिक्रिया के बारे में इलेक्ट्रोड की स्थिति के लिए वांछित पेशी सिकुड़ा प्रभाव बटोर प्रदान का लाभ है. इस पांडुलिपि के प्रयोजन के लिए, हम एक माउस hindlimb के पूर्वकाल कम्पार्टमेंट मांसपेशियों की मांसपेशियों उत्तेजना के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे.
Protocol
1. इलेक्ट्रोड तैयार
- एक 1 सेमी एक्स 1 वेक्टर सर्किट बोर्ड के सेमी अनुभाग काटो.
- 2 wirewrap एक उप पकड़ लगभग 3.5 मिमी अलग स्थान पिन के साथ, पिन का उपयोग कर स्थिर. पिन का बंटवारा छोर का सामना होना चाहिए.
- एक 90 ° कोण पर पिन wirewrap, अपनी लंबाई के साथ लगभग आधे रास्ते, needlenose सरौता का उपयोग झुको.
- तार इन्सुलेशन विपठ्ठन द्वारा connectors के नेतृत्व कनेक्शन से लगभग 7 सेमी, तांबे के तारों को बेनकाब.
- एक wirewrap पिन के अंत बंटवारा एक तांबे के तारों की मिलाप. पिन अन्य wirewrap के लिए टांका चरण को दोहराएँ.
- तांबे के तारों और सोने की पिन के बीच soldered कनेक्शन पर टयूबिंग हटना क्रम में बचाने के लिए और को स्थिर खींचो. गर्मी टांका लगाने की टिप का उपयोग कर टयूबिंग.
- Breadboard सर्किट बोर्ड के आसन्न उद्घाटन में wirewrap पिंस unsoldered सुझाव डालें.
- सुनिश्चित करें कि wirewrap पिन एक दूसरे के समानांतर और सेंटऐसी है कि युक्तियाँ एक ही दूरी स्थित हैं जब बोर्ड के माध्यम से रखा breadboard के माध्यम से ick.
- स्पष्ट epoxy में पिन के soldered छोर एम्बेड. Epoxy के लगभग 10 मिनट के लिए इलाज करने की अनुमति दें, या पूरी तरह से सूखा जब तक.
- Epoxy के आवेदन दोहराएँ जब तक पिंस और वेक्टर सर्किट बोर्ड पूरी तरह से क्रम में करने के लिए संरचनात्मक अखंडता और नेतृत्व तारों के लिए तनाव राहत प्रदान करने के लिए एम्बेडेड रहे हैं.
- एक धातु फ़ाइल का उपयोग करने के लिए सोने की पिन के सुझावों को बेनकाब epoxy के नीचे रेत.
- एक multimeter का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें दो सुराग विद्युत shorted नहीं हैं और नेतृत्व तारों उचित निरंतरता है
- संलग्न इलेक्ट्रोड NMES डिवाइस से महिला 2 - जिस तरह से तार संबंधक (Pomona पैच कॉर्ड) की ओर जाता है.
2. पशु तैयारी
- पशु साँस लेना के माध्यम से संवेदनाहृत 100% ओ 2 गैस में 2% isofluorane (Abbott प्रयोगशालाओं, उत्तर शिकागो, आईएल) का उपयोग कर रहे हैं. यह पशु टी भर संवेदनाहृत रहना चाहिएवह सत्र NMES.
- शुरू करने से पहले NMES प्रोटोकॉल एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें कि जानवर पूरी तरह anesthetized है.
- पशु नियमित रूप से उत्तेजना के जवाब के लिए जाँच की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए संवेदनाहारी स्तर पर्याप्त है. संज्ञाहरण के रूप में की जरूरत है समायोजित किया जाना चाहिए. उत्तेजित पैर, सांस की गहराई में परिवर्तन, और श्लेष्म झिल्ली के रंग के अलावा अन्य सभी आंदोलन नियमित रूप से संज्ञाहरण की गहराई पर नजर रखने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
- पार्श्व अवलंबन में पशु स्थिति.
- आँखों नेत्र स्नेहक लागू प्रक्रिया के दौरान corneal सुखाने को रोकने के क्रम में.
- Hindlimb क्षेत्र दाढ़ी के लिए इलाज किया जाना है, और शराब के साथ पोंछे.
- 3% ब्लीच के साथ इलेक्ट्रोड पोछो, फिर पानी से कुल्ला.
- साइट जहां इलेक्ट्रोड लागू किया जाएगा पर जेल चलाने की एक परत लागू करें. NMES प्रोटोकॉल भर में आवश्यक के रूप में पुन: लागू करने के लिए इलेक्ट्रोड और त्वचा के बीच वर्तमान के प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए.
- एक गर्मी दीपक ओआर परिसंचारी पानी कंबल सामान्य कोर शरीर पर्वतमाला को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- नोट: सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा मंजूरी दे दी है और आश्वासन दिया PHS और AAALAC के Int में प्रदर्शन किया. मान्यता प्राप्त कार्यक्रम और सुविधाओं.
3. उत्तेजना
- इलेक्ट्रोड नियुक्ति:
- पूर्वकाल tibialis पूर्वकाल और प्रसारिणी digitorum longus मांसपेशी सहित डिब्बे, मांसपेशियों की उत्तेजना के लिए, सीधे पशु गहरी अनुजंघास्थिक तंत्रिका है, जो आम peroneal तंत्रिका के बाहर शाखा बंद है पर सतह इलेक्ट्रोड जगह है, और बस के लिए पूर्वकाल में स्थित है अनुजंघास्थिक सिर.
- पूर्वकाल कम्पार्टमेंट मांसपेशियों की उत्तेजना के लिए इलेक्ट्रोड की नियुक्ति की पुष्टि की है जब उत्तेजना पूर्ण टखने के पीछे की ओर मुडना और अंकों के पूर्ण विस्तार elicits में. दूसरी ओर, पीछे की ओर मुडना, अंक विस्तार के अभाव में पता चलता है कि केवल tibialis पूर्वrior मांसपेशी प्रेरित किया जा रहा है. इस तरह के एक लक्षित सिकुड़ा प्रतिक्रिया वांछनीय अध्ययन डिजाइन के आधार पर, हो सकता है.
- मांसपेशियों में संकुचन एक मुक्त चलती, गाढ़ा चरण ~ जो आरंभिक दौरान होता 0.5 सेकंड: उत्तेजना के 2 चरणों में विभाजित है. इस पहले चरण के दौरान, पंजा एक आराम की स्थिति से अधिक से अधिक पीछे की ओर मुडना और अंक विस्तार करने के लिए कदम है. उत्तेजना के दूसरे चरण एक isometric अंत रेंज और पीछे की ओर मुडना अंक विस्तार पर निरंतर संकुचन है.
- उत्तेजना मापदंडों:
- इस NMES मॉडल 300 पी.वी. Empi multifunction के विद्युत उपकरण है, जो पारंपरिक NMES की 2 चैनलों प्रदान करता है (टेबल देखें) का इस्तेमाल. इस मॉडल के प्रयोजनों के लिए, केवल 1 चैनल के लिए प्रयोग किया जाता है.
- इस्तेमाल किया पैरामीटर सममित तरंग, 150 μs की एक स्पंद अवधि और 50Hz की आवृत्ति शामिल हैं. उत्तेजना समय 5 सेकंड के लिए सेट कर दिया जाता है, एक 0.5 सेकंड रैंप ऊपर और एक 0.5 सेकंड नीचे रैंप के साथ. यह मांसपेशियों और अधिक धीरे - धीरे accli की अनुमति देगाउत्तेजना के लिए दोस्त है. वर्तमान प्रोटोकॉल में, 10 सेकंड के लिए समय बंद संकुचन के बीच में स्थापित किया गया था, लेकिन यह वांछित प्रभाव के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. बार बंद में कमी, मांसपेशियों की थकान की एक और अधिक तेजी से दीक्षा में परिणाम देगा. इन उत्तेजना मापदंडों नैदानिक महत्वपूर्ण कंकाल की मांसपेशी एक क्षति, 15, 16 उत्प्रेरण के बिना पेशी शक्ति, neuromuscular बिजली उत्तेजना का उपयोग बढ़ाने के लिए बनाया प्रोटोकॉल पर आधारित थे.
- चूहे 10 संकुचन के दो सेट पूरा सेट के बीच में 5 मिनट आराम के साथ.
- वयस्क पशुओं के लिए, NMES तीव्रता आम तौर पर 9 मा शुरू की है. हमारे अनुभव से, यह अधिक से अधिक शुरू तीव्रता कि उत्तेजना के बाद एक ध्यान देने योग्य चाल हानि प्रेरित नहीं करता तुरंत करने के लिए अनुमानित है. बाद NMES सत्र के लिए, तीव्रता 1 मा द्वारा हर समय पशुओं के 20 पूर्ण dorsiflexions को पूरा कर सकते हैं बढ़ जाती है.
- उत्तेजना प्रोटोकॉल और reco के पूरा होने के बादसंज्ञाहरण से बहुत, जानवरों को आमतौर पर एक सामान्य चाल और मुद्रा का प्रदर्शन. NMES कार्यक्रम की अवधि के दौरान चाल अछूता रहना चाहिए.
4. प्रतिनिधि परिणाम
जंगली (B6/10) के प्रकार, B6.SCID और MDX / SCID चूहों NMES: इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल सहित कई माउस उपभेदों में लागू किया गया है. 3-5 महीने में 4 सप्ताह (20 सत्र) पर प्रदर्शन NMES के प्रतिनिधि परिणाम पुराने / MDX SCID प्रस्तुत कर रहे हैं.
पशु humanely जबकि संज्ञाहरण के तहत ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized किया गया. tibialis पूर्वकाल पेशी काटा गया था और 2 मिथाइल - ब्यूटेन तरल नाइट्रोजन में पूर्व ठंडा है, और -80 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस में तुरंत जमे हुए धारावाहिक पार वर्गों (10 माइक्रोन) प्राप्त किया गया और स्लाइड पर घुड़सवार. सांख्यिकीय विश्लेषण मानक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर संकुल (SPSS, v19.0 सॉफ्टवेयर) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. सबसे पहले, Levene परीक्षण करने के लिए कि क्या वहाँ पानी का आकलन किया गया थाप्रसरण की समानता. स्वतंत्र टी परीक्षण के नमूने तो NMES और नियंत्रण समूहों के बीच मतभेद की जांच करने के लिए किया गया था.
जांच करने के लिए क्या NMES प्रोटोकॉल dystrophic मांसपेशियों में वृद्धि की चोट में परिणाम होगा hematoxylin और लाल भामसान रंग के धब्बे (एच एंड ई) प्रदर्शन किया गया. एक अनुभाग में चयनित किया गया था और चित्रों को प्रकाश माइक्रोस्कोप (Nikon ग्रहण E800, Nikon है, जापान) का उपयोग कर प्राप्त किया गया. विकसित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, छवि जे वहाँ उत्थान सूचकांक में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी (केन्द्र nucleated फाइबर की संख्या फाइबर और केन्द्र स्थित नाभिक के साथ फाइबर की संख्या की कुल संख्या मैन्युअल रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के उपयोग की गिनती की गई चित्र 1); / तंतुओं के कुल NMES को प्रस्तुत पशुओं में) संख्या, के रूप में नियंत्रण (= पी 0.802 करने के लिए तुलना में. यह पता चलता है कि NMES के आवेदन अध: पतन - उत्थान झरना dystrophic पशुओं में मनाया में वृद्धि नहीं करता है, और इसलिए संभावना नहीं हैके लिए एक वृद्धि की मांसपेशी की चोट उत्प्रेरण.
CD31 के लिए immunofluorescent धुंधला के मांसपेशी vascularity पर 4 सप्ताह NMES प्रोटोकॉल के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था. संक्षेप में, मांसपेशी वर्गों 4 formalin% में तय किया गया और 5% हार्स सीरम (एचएस) का उपयोग अवरुद्ध. धारा एक चूहा विरोधी माउस प्राथमिक एंटीबॉडी (5% एच एस में कमजोर पड़ने 1:300) के साथ incubated रहे थे और एक 555-लेबल बकरी विरोधी चूहा माध्यमिक एंटीबॉडी (5% एच एस में कमजोर पड़ने 1:300) के साथ इलाज किया. CD31 सकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या यों, एक अनुभाग का चयन किया गया था और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (Nikon ग्रहण E800, जापान) का उपयोग कर फोटो खिंचवाने. capillaries की कुल संख्या मैन्युअल उत्तरी ग्रहण सॉफ्टवेयर (Empix इमेजिंग, Inc) का उपयोग कर गिना गया था. CD31 NMES को प्रस्तुत पशुओं में सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में एक उल्लेखनीय वृद्धि जब नियंत्रण (पी <0.01, चित्रा 2) की तुलना में था, यह दर्शाता है कि NMES प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित कंकाल की मांसपेशी angiogenesis को बढ़ावा देता है.
Dystrophic का आंकड़ा 1 Hematoxylin और लाल भामसान रंग कंकाल की मांसपेशी धुंधला (MDX) / immunodeficient चूहों (4-5 महीने) (10x बढ़ाई): एक) अनुपचारित नियंत्रण, बी NMES की 4 सप्ताह के बाद).
आंकड़ा 2 CD31 immunofluorescence (लाल), dystrophic के कंकाल की मांसपेशी (MDX) / immunodeficient चूहों (4-5 महीने) (20x बढ़ाई) ए) अनुपचारित नियंत्रण में, कंकाल की मांसपेशी vascularity के एक मार्कर के रूप में, बी) के 4 हफ्तों के बाद NMES.
चित्रा 3 सिकुड़ा परीक्षण.नियंत्रण में पूर्वकाल कम्पार्टमेंट मांसपेशियों और 4 सप्ताह के लिए NMES साथ पशुओं का इलाज. MNM = milli न्यूटन मीटर की दूरी पर है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
Discussion
इन परिणामों का सुझाव है कि हमारे NMES की murine मॉडल विकसित कंकाल की मांसपेशी (चित्रा 2) angiogenesis और मजबूत बनाने (चित्रा 3) को बढ़ावा देता है, लेकिन कंकाल की मांसपेशी क्षति (चित्रा 1) प्रेरित नहीं है.
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उत्तेजना यहाँ वर्णित मापदंडों पूर्वकाल कम्पार्टमेंट मांसपेशियों को ओवरलोडिंग मांसपेशी को प्रेरित करने के लिए डिजाइन किया गया है. बस के रूप में नैदानिक परिदृश्यों के लिए मामला है, इलेक्ट्रोड नियुक्ति के लिए अन्य मांसपेशी समूहों को प्रोत्साहित करने के लिए, हालांकि मांसपेशी NMES करने के लिए प्रतिक्रिया अलग हो, फाइबर प्रकार संरचना पर निर्भर करता है समायोजित किया जा सकता है. NMES अवधि, उपचार सत्रों की कुल संख्या, और repetitions की कुल संख्या के लिए डिजाइन अध्ययन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है.
किसी भी प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, इस विधि की सीमाओं कि ध्यान दिया जाना चाहिए. वर्तमान अध्ययन में, उत्तेजना पर गहरी अनुजंघास्थिक तंत्रिका किया गया था. हालांकि, क्लिनिक में, मैं उत्तेजनाहै आमतौर पर मोटर इकाई में दिलाई. पशु मॉडल में, तंत्रिका की उत्तेजना कम तीव्रता की आवश्यकता है ताकि पूरा मांसपेशी संकुचन को प्रकाश में लाना होगा. प्रस्तुत के रूप में मॉडल की एक और सीमा यह है कि हम करने के लिए NMES के आवेदन के दौरान आराम के स्तर के बारे में जानकारी प्राप्त करने में असमर्थ हैं, दिया कि जानवरों संवेदनाहृत हैं. इसलिए, एक नैदानिक आबादी की तुलना में तीव्रता की सहनशीलता का आकलन करना मुश्किल है. हालांकि, हमारे ऊतकीय परिणाम हमारे NMES मॉडल का सुझाव है, के रूप में वर्णित है, मांसपेशियों में चोट प्रेरित नहीं करता.
विकास जानवरों मॉडल है कि नकल रूपरेखा सामान्यतः क्लिनिक में लागू उपयोगी प्रयोगशाला उपकरण है कि इलाज के उपायों के लिए सेलुलर और आणविक प्रतिक्रियाओं की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देता है के साथ हमें प्रदान की. इसके अलावा, इस तरह के मॉडल के लिए पूर्व नैदानिक अध्ययन का संचालन करने के लिए दोनों मौजूदा पुनर्वास प्रोटोकॉल को निखारने और उपन्यास संकेत विकसित करने के लिए उपयोगी होते हैं.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य K12 (NIH) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा पुनर्वास रिसर्च ट्रेनिंग में शारीरिक और व्यावसायिक चिकित्सक के व्यापक अवसर (HD055931 K12), शारीरिक थेरेपी और पिट्सबर्ग क्लाड डी पेप्पर पुराने अमेरिकियों स्वतंत्रता केंद्र के लिए फाउंडेशन (AG024827 p30 के लिए वित्त पोषित किया गया ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector wire wrap posts with bifurcated solder terminal | Newark Inc | T68 | |
| Vector circuit board | Newark Inc | 3662-2 | |
| Pomona patch cord | Newark Inc | P-36-0 | |
| 5 minute epoxy | VO Baker Co. | 4001 | |
| Spectra 360 Electrode Gel | Milliken Medical | MR41217 | |
| Portable neuromuscular stimulation device | EMPI | 300pv |
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