Summary
En grundlæggende protokol til adskillelse af DNA fragmenter ved hjælp af agarosegel-elektroforese er beskrevet.
Abstract
Agarosegel-elektroforese er den mest effektive måde at adskille DNA-fragmenter med forskellige størrelser i området fra 100 bp til 25 kb 1. Agarose isoleres fra tang slægterne Gelidium og Gracilaria, og består af gentagne agarobiose (L-og D-galactose) underenheder 2. Under gelering, forbinder agarose polymerer ikke-kovalent og danner et netværk af bundter, hvis porestørrelser bestemme en gelens molekylære sigtning egenskaber. Anvendelse af agarose gel elektroforese revolutioneret adskillelse af DNA. Forud for vedtagelsen af agarose geler, blev DNA primært separeret ved hjælp af sucrosemassefyldegradient centrifugering, som kun gav en tilnærmelse af størrelse. At adskille DNA under anvendelse af agarosegelelektroforese DNA'et indføres i præfabrikerede brønde i gelen og en strøm påført. Den phosphatrygraden af DNA (og RNA) molekyle er negativt ladet, således når det anbringes i et elektrisk felt, vil DNA-fragmenter migrere til positively opladet anode. Fordi DNA har en ensartet masse / ladningsforhold, er DNA-molekyler separeres efter størrelse under en agarosegel i et mønster, således at den tilbagelagte afstand er omvendt proportional med log af dets molekylvægt 3. Den førende model for DNA bevægelse gennem en agarosegel er "forspændt reptation", hvorved den forreste kant bevæger sig fremad og trækker resten af molekylet langs 4. Hastigheden af vandringen af et DNA-molekyle via en gel afhænger af det følgende: 1) størrelsen af DNA-molekyle, 2) agarose koncentration, 3) DNA konformation 5, 4) påtrykkes, 5) tilstedeværelsen af ethidiumbromid, 6) type agarose og 7) elektroforese buffer. Efter separation kan DNA-molekylerne kan visualiseres under ultraviolet lys efter farvning med et passende farvestof. Ved at følge denne protokol, skal eleverne være i stand til:
- Forstå mekanismen, ved hvilken DNA-fragmenter adskilles på en gelmatrix
- Forstå, hvordan konformationDNA-molekyle vil bestemme dets mobilitet ved hjælp af en gelmatrix
- Identificer en agarose opløsning af passende koncentration for deres behov
- Fremstille en agarosegel til elektroforese af DNA-prøver
- Opsætte gelelektroforese apparat og strømforsyningen
- Udvælge en passende spænding til adskillelse af DNA-fragmenter
- Forstå mekanismen, ved hvilken ethidiumbromid muliggør visualisering af DNA-bånd
- Bestem størrelsen af adskilte DNA-fragmenter
Protocol
1. Fremstillinq af gelen
- Afvej en passende masse agarose i en Erlenmeyer-kolbe. Agarose geler fremstilles ved anvendelse w / v procentdel opløsning. Koncentrationen af agarose i en gel, vil afhænge af størrelsen af DNA-fragmenterne, der skal separeres, med de fleste geler på mellem 0,5% -2%. Volumenet af puffer bør ikke være større end 1/3 af kapaciteten af kolben.
- Tilsættes løbende buffer til agarose-holdige kolbe. Swirl at blande. Den mest almindelige gel kører buffere TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) og TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA).
- Smelte agarosen / buffer blanding. Dette er mest almindeligt udføres ved opvarmning i en mikrobølgeovn, men kan også ske over en bunsenbraender. Efter 30 s intervaller, fjernes kolben og slyng indholdet til bland godt. Gentag indtil agarosen er helt opløst.
- Tilsættes ethidiumbromid (EtBr) til en koncentration på 0,5 ug / ml. Alternativt kan gelen også farves efter elektrophoresis i strømmende puffer indeholdende 0,5 ug / ml EtBr i 15-30 minutter, efterfulgt af affarvning i strømmende puffer til en lige lang tid.
Bemærk: EtBr er et mistænkt carcinogen og skal bortskaffes korrekt pr institutionens regler. Handsker bør altid anvendes ved håndtering geler, der indeholder EtBr. Alternative farvestoffer til farvning af DNA er til rådighed, men EtBr fortsat det mest populære på grund af sin følsomhed og omkostninger.
- Tillade agarose afkøle enten benchtop eller ved inkubering i en 65 ° C vandbad. I modsat fald vil warpe gelen bakken.
- Placer gelen bakken i støbeapparatet. Alternativt kan man også tape åbne kanter af en gel bakke for at skabe en støbeform. Et passende kam ind i gelen formen for at skabe brøndene.
- Hæld den smeltede agarose i gelen formen. Tillade agarose at indstille ved stuetemperatur. Fjerne kam og placere gelen i gelen kassen. Alternativt gel kan også pakkes i plastfolie og opbevaret ved 4 ° C indtil anvendelse (fig. 1).
2. Etablering af gelapparat og adskillelse af DNA fragmenter
- Tilsættes lastning farvestof til DNA-prøverne, der skal adskilles (fig. 2). Gel loading dye fremstilles typisk ved 6X koncentration (0,25% bromphenolblåt, 0,25% xylencyanol, 30% glycerol). Loading farvestof hjælper med at spore, hvor langt din DNA-prøve har rejst, og tillader også prøve at synke ned i gelen.
- Program strømforsyningen til den ønskede spænding (1-5V/cm mellem elektroder).
- Tilsættes tilstrækkeligt flydende buffer til at dække overfladen af gelen. Det er vigtigt at anvende den samme flydende buffer som den, der anvendes til fremstilling af gelen.
- Sæt ledningerne i gelen kassen til strømforsyningen. Tænd for strømmen og kontrollere, at både gel kasse og strømforsyning virker.
- Tag låget af. Langsomtog omhyggeligt indlæse DNA-prøve (r) i gelen (fig. 3). En passende DNA-størrelse markør bør altid lægges sammen med eksperimentelle prøver.
- Låget til gelen kassen. Katoden (sorte ledninger) skal være tættere brøndene end anoden (røde ledninger). Dobbelttjekke at elektroderne er sat i de rigtige slots i strømforsyningen.
- Tænd for strømmen. Løber gelen, indtil farvefronten har migreret til en passende afstand.
3. Observere Separerede DNA-fragmenter
- Når elektroforese er færdig, skal du slukke for strømmen, og tag låget af gelen kassen.
- Fjerne gel fra gelen kassen. Dræne overskydende buffer fra overfladen af gelen. Placer gelen bakken på køkkenrulle for at absorbere eventuelle ekstra kører buffer.
- Gelen fjernes fra gelen bakken og udsætte gelen for UV-lys. Dette er mest almindeligt udføres under anvendelse af en gel dokumentation system (fig. 4). DNA-bånd bør viseop som orange fluorescerende bånd. Tager et billede af gelen (fig. 5).
- Korrekt bortskaffelse af gelen og kører buffer pr institutionens regler.
4. Repræsentative resultater
Figur 5 viser et typisk resultat efter agarosegel-elektroforese af PCR-produkter. Efter separation, er de resulterende DNA-fragmenter synlig klart definerede bånd. DNA standard eller stigen skal adskilles i en grad, der muliggør nyttig bestemmelse af størrelsen af prøven bånd. I det viste eksempel er DNA-fragmenter med 765 bp, 880 bp og 1022 bp separeret på en 1,5% agarosegel sammen med en 2-log DNA-stige.
Figur 1. Et størknet agarosegel efter fjernelse af kammen.
Figur 2. En studerende, tilføjer loading dye til hendes DNA-prøver.
Figur 3. En elev lastning DNA-prøven i en brønd i gelen.
Figur 4. Et eksempel på en gel dokumentation system.
Figur 5. Et billede af en gel efter elektroforese. EtBr blev tilsat til gelen, før elektroforese til en slutkoncentration på 0,5 ug / ml, efterfulgt af adskillelse ved 100 V i 1 time. Gelen blev eksponeret for UV-lys, og billedet taget med en gel dokumentation system.
Discussion
Agarosegelelektroforese har vist sig at være en effektiv måde til at separere nukleinsyrer. Agarose s høj gelstyrke muliggør håndtering af lav procentdel geler til adskillelse af store DNA-fragmenter. Molekylær sigtning bestemmes af størrelsen af porerne dannes af bundter af agarose 7 i gelmatrixen. I almindelighed. Jo højere koncentrationen af agarose, jo mindre porestørrelse Traditionelle agarosegeler er mest effektive ved adskillelse af DNA-fragmenter mellem 100 bp og 25 kb. At adskille DNA-fragmenter større end 25 kb, vil man bruge puls felt gel elektroforese 6, som involverer anvendelsen af vekselstrøm fra to forskellige retninger. På denne måde større størrelse DNA-fragmenter adskilles ved den hastighed, hvormed de reorientere sig ændringer i strømretningen. DNA-fragmenter mindre end 100 bp, er mere effektivt separeres ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese. I modsætning tilagarosegeler er polyacrylamidgel matrix dannet ved fri radikal-drevet kemisk reaktion. Disse tyndere geler er af højere koncentration, der løber lodret og har bedre opløsning. I moderne DNA sekventering kapillarelektroforese anvendes, hvorved kapillarrørene er fyldt med en gelmatrix. Anvendelsen af kapillarrørene tillader anvendelse af høje spændinger, hvorved adskillelsen af DNA-fragmenter (og bestemmelse af DNA-sekvensen) hurtigt.
Agarose kan modificeres til at skabe lavtsmeltende agarose gennem hydroxyethylering. Lavtsmeltende agarose anvendes generelt, når isoleringen af adskilte DNA-fragmenter er ønsket. Hydroxyethylering reducerer pakningstætheden af agarose bundter, der effektivt reducerer deres porestørrelse 8. Dette betyder, at et DNA-fragment af samme størrelse vil tage længere tid at bevæge sig gennem en lavtsmeltende agarosegel i modsætning til et standard agarosegel. Fordi bundterne associerer med hinandenved ikke-kovalente interaktioner 9, er det muligt at genopsmelte en agarosegel efter at det er sat.
EtBr er den mest almindeligt reagens, der anvendes til at farve DNA'et i agarosegeler 10. Når de udsættes for UV-lys, der elektroner i den aromatiske ring af ethidium-molekylet aktiveres, hvilket fører til frigivelse af energi (lys) som elektroner tilbagevenden til grundtilstanden. EtBr virker ved indskydning sig i DNA-molekylet på en koncentrationsafhængig måde. Dette muliggør en beregning af mængden af DNA i en bestemt DNA-bånd baseret på dens intensitet. På grund af den positive ladning, reducerer anvendelsen af EtBr DNA vandringshastigheden med 15%. EtBr er en mistænkt mutagen og kræftfremkaldende, derfor må man udvise forsigtighed, når du håndterer agarosegeler indeholdende det. Desuden er EtBr betragtes farligt affald og skal bortskaffes på passende vis. Alternative pletter for DNA i agarosegeler omfatter SYBR Gold, SYBR Green, krystalviolet og Methyl Blue. Af disse,Methyl blå og krystalviolet ikke kræver eksponering af gelen til UV-lys til visualisering af DNA-bånd, hvilket reducerer sandsynligheden for mutation, hvis genvinding af DNA-fragmentet fra gelen ønskes. Imidlertid er deres følsomhed er lavere end EtBr. SYBR Gold og SYBR green er begge meget følsomme, UV afhængige farvestoffer med lavere toksicitet end EtBr, men de er betydeligt dyrere. Desuden er alle de alternative farvestoffer enten ikke kan være eller ikke fungerer godt, når de tilsættes direkte til gelen, således at gelen skal være stilling farves efter elektroforese. På grund af omkostninger, brugervenlighed, og følsomhed, der stadig EtBr er farvestoffet valg for mange forskere. Imidlertid er i visse situationer, såsom når bortskaffelse af farligt affald er vanskeligt, eller når unge studerende udfører et eksperiment, kan et mindre toksisk farvestof foretrækkes.
Lastning farvestoffer, der anvendes i gelelektroforese tjener tre vigtige formål. Først tilføjer tæthed til prøven, Gør det muligt at synke ind i gelen. Sekund, farvestofferne give farve og forenkle ladeprocessen. Endelig farvestoffer bevæger sig standardtakster gennem gelen, der giver mulighed for vurdering af den afstand, DNA-fragmenter har migreret.
De nøjagtige størrelse adskilte DNA-fragmenter kan bestemmes ved at afbilde logaritmen af molekylvægten for de forskellige bånd af et DNA standard mod den afstand, som hvert bånd. DNA standard indeholder en blanding af DNA-fragmenter med forudbestemte størrelser, der kan sammenlignes med de ukendte DNA-prøver. Det er vigtigt at bemærke, at forskellige former af DNA bevæger sig gennem gelen med forskellige hastigheder. Supersnoet plasmid-DNA, på grund af dens kompakte konformation, bevæger sig gennem gelen hurtigste, efterfulgt af en lineær DNA-fragment af samme størrelse, med den åbne cirkulære form bevæger den langsomste.
Afslutningsvis, idet indførelse af agarosegeler i 1970'erne til adskillelse af DNA harvist sig at være en af de mest nyttige og alsidige teknikker i biologiske videnskaber forskning.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne Incorporated | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd, (2001).
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
- Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. , Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).
