Summary
Основной протокол для разделения фрагментов ДНК использованием электрофореза в агарозном геле описано.
Abstract
Агарозном гель-электрофореза является наиболее эффективным способом разделения фрагментов ДНК различных размеров, начиная от 100 б.п. до 25 кб 1. Агарозном изолирован от водорослей родов Gelidium и Gracilaria, и состоит из повторяющихся agarobiose (L-и D-галактозы) подразделения 2. Во время гелеобразования, агарозы полимеров связывают нековалентно и образуют сеть расслоений, размеры пор определить молекулярный просеивания геля свойствами. Использование электрофореза в агарозном геле революцию разделения ДНК. До принятия агарозном геле, ДНК в основном разделяются с помощью сахарозы центрифугирования в градиенте плотности, которые только при условии приближения размера. Для выделения ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, ДНК загружается в сборных скважин в гель и ток. Фосфатного остова ДНК (и РНК), молекула имеет отрицательный заряд, поэтому при помещении в электрическое поле, фрагменты ДНК, будут переходить на рositively заряженный анод. Поскольку ДНК имеет однородную массу / заряду молекулы ДНК разделяются по размеру в агарозном геле в шаблон так, что расстояние, пройденное обратно пропорциональна логарифму его молекулярной массы 3. Ведущие модели ДНК движение через агарозном геле "предвзятым рептаций", в результате чего передний край движется вперед и тянет остальной части молекулы по 4. Скорость миграции молекулы ДНК через гель определяется: 1) размер молекулы ДНК, 2) концентрация агарозы, 3) ДНК конформации 5, 4) приложенного напряжения, 5) наличие бромистый этидий, 6) типа агарозы и 7), электрофорез буфера. После разделения молекул ДНК могут быть визуализированы в УФ-свете после окрашивания с соответствующим красителем. Следуя этому протоколу, студенты должны уметь:
- Понять механизм, посредством которого фрагменты ДНК разделяются в матрице геля
- Понять, как конформацииМолекула ДНК определяет его мобильность через матрицу геля
- Определить решение агарозном соответствующей концентрации для своих нужд
- Подготовить агарозном геле для электрофореза образцов ДНК
- Настройка аппарата гель-электрофореза и источник питания
- Выберите подходящее напряжение для разделения фрагментов ДНК
- Понять механизм, посредством которого бромистый этидий позволяет визуализации ДНК полосы
- Определить размеры отдельных фрагментов ДНК
Protocol
1. Подготовка геля
- Взвесить соответствующей массы агарозы в колбу. Агарозном гелях готовятся с использованием AW / в процентах решение. Концентрация в агарозном гель будет зависеть от размеров фрагментов ДНК должны быть разделены, при этом большинство гелей от 0,5% -2%. Объем буфера не должен превышать 1/3 емкости колбы.
- Добавить работает буфер для агарозы содержащей колбу. Swirl перемешать. Наиболее распространенными гель работает буфер TAE (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА) и КЭ (45 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА).
- Растопить агарозы / буферной смеси. Это обычно делается путем нагревания в микроволновой печи, но также может быть сделано в пламени Бунзена. На каждые 30 сек, снимите колбу и вращать содержимое хорошо перемешать. Повторяйте, пока агарозном полностью растворится.
- Добавить этидия бромид (EtBr) в концентрации 0,5 мкг / мл. Кроме того, гель может также быть окрашены после электрофорез в управлении буфером, содержащим 0,5 мкг / мл EtBr на 15-30 мин, после чего destaining в управлении буфер равный промежуток времени.
Примечание: EtBr это канцероген и должны быть должным образом утилизированы в учреждении нормам. Перчатки должны всегда носить при работе гели, содержащие EtBr. Альтернативные красители для окрашивания ДНК имеются, однако EtBr остается наиболее популярным благодаря своей чувствительности и стоимости.
- Дайте остыть в агарозном или на настольный или инкубации 65 ° С на водяной бане. Невыполнение этого требования будет деформироваться гель лоток.
- Поместите гель в поднос литье аппарата. Кроме того, можно также записать на пленку открытые края геля лоток для создания формы. Поместите соответствующий гребень в форме геля для создания скважин.
- Залить расплавленным агарозном геле в форме. Позвольте агарозном установить при комнатной температуре. Снимите гребень и поместить гель в геле окно. Кроме того, гЭль можно заворачивать в пищевую пленку и хранить при температуре 4 ° C до использования (рис. 1).
2. Настройка Аппарата гель и разделения фрагментов ДНК
- Добавить загрузки краски образцы ДНК должны быть разделены (рис. 2). Гель для загрузки красителя, как правило, сделаны на 6X концентрации (0,25% бромфенол синий, 0,25% ксилола cyanol, 30% глицерина). Загрузка красителя помогает отслеживать, насколько ваш образец ДНК путешествовал, а также позволяет образца погружаются в гель.
- Программа питания для требуемого напряжения (1-5V/cm между электродами).
- Добавьте достаточно работы буфера, чтобы покрыть поверхность геля. Важно, чтобы использовать те же работает буфер, который используется для подготовки гель.
- Присоединить провода геля в поле питания. Включите питание и убедитесь, что оба окна гель и питания работают.
- Снимите крышку. Медленнои тщательно загрузить образец ДНК (ы) в геле (рис. 3). Соответствующий маркер размера ДНК всегда должны быть загружены, а также экспериментальные образцы.
- Замените крышку гель окно. Катод (черный провода) должны быть ближе, чем скважин анода (красные провода). Дважды убедитесь, что электроды подключены к правильным слотов в блоке питания.
- Включите питание. Запустите гель до красителя мигрировали в соответствующем расстоянии.
3. Наблюдение Отдельные фрагменты ДНК
- При электрофорезе завершена, выключите питание и снимите крышку геля окно.
- Удаление геля из геля окно. Слейте лишнюю буфера с поверхности геля. Поместите гель лоток на бумажные полотенца, чтобы поглотить любые дополнительные работы буфера.
- Удаление геля из геля лоток и подвергать гель УФ света. Это обычно делается с помощью системы гель документации (рис. 4). ДНК полосы должны показыватькак оранжевые люминесцентные полосы. Сфотографируйте гель (рис. 5).
- Правильно распоряжаться гель и работает буфер в учреждении нормам.
4. Представитель Результаты
Рисунок 5 представляет собой типичный результат после электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР. После разделения, в результате фрагменты ДНК видны как четко определенные группы. Стандарт ДНК или лестница должна быть отделена до такой степени, что позволяет полезным определение размеров образца полосы. В приведенном примере, фрагменты ДНК из 765 б.п., 880 б.п. и 1022 б.п. разделены на 1,5% агарозном геле, а также 2-журнала ДНК лестнице.
Рисунок 1. Укрепил агарозном геле после удаления гребенки.
Рисунок 2. Студент добавления красителя загрузки ее образцов ДНК.
Рисунок 3. Студент загрузки образцов ДНК в колодец в геле.
Рисунок 4. Пример системы документации геля.
Рисунок 5. Изображение электрофорез сообщение геля. EtBr был добавлен в гель до электрофореза в конечной концентрации 0,5 мкг / мл, с последующим разделением на 100 В в течение 1 часа. Гель под воздействием УФ света и сфотографироваться с документацией по системе гель.
Discussion
Агарозном гель-электрофореза оказался действенным и эффективным способом разделения нуклеиновых кислот. Высокая прочность геля агарозы позволяет при обращении с низким процент гели для отделения больших фрагментов ДНК. Молекулярные сита определяется размер пор порожденных пучками агарозном 7 в матрице геля. В общем, чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор. Традиционные гели агарозы являются наиболее эффективными на разделение фрагментов ДНК от 100 б.п. и 25 кб. Чтобы выделить фрагменты ДНК размером более 25 кб, надо будет использовать импульс поле гель-электрофореза 6, который предусматривает применение переменного тока от двух разных направлениях. Таким образом, более крупные фрагменты ДНК разделяются по скорости, с которой они переориентируются с изменением направления тока. Фрагменты ДНК менее 100 б.п. более эффективно разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В отличие отагарозном геле, матрица полиакриламидном геле формируется за счет свободных радикалов управляемой химической реакции. Эти тонкие гели имеют более высокую концентрацию, стоят вертикально и имеют более высокое разрешение. В современном секвенирования ДНК капиллярного электрофореза используются, в результате чего капилляры наполняются гель матрицы. Использование капилляров позволяет применение высоких напряжений, что позволяет разделения фрагментов ДНК (и определения последовательности ДНК) быстрее.
Агарозы может быть изменен для создания низкой температурой плавления агарозы через гидроксиэтилирования. Низкий плавления агарозы, как правило, используется при выделении отдельных фрагментов ДНК лучшего. Гидроксиэтилирования уменьшает плотность упаковки пучки агарозы, эффективно уменьшая их размер пор 8. Это означает, что фрагмент ДНК одного и того же размера потребуется больше времени для перемещения по низкой температурой плавления агарозном геле, в отличие от стандартных агарозном геле. Поскольку пучки связывают друг с другомчерез нековалентных взаимодействий 9, можно повторно расплавить агарозном геле после его установки.
EtBr является наиболее распространенным реагента, который используется для окрашивания ДНК в агарозном геле 10. Под воздействием ультрафиолетового излучения, электроны в ароматическое кольцо молекулы этидия активизируются, что приводит к освобождению энергии (света), а электроны возвращаются на землю государства. EtBr работает интеркалирующих себя в молекуле ДНК в зависимости от концентрации. Это позволяет для оценки количества ДНК в той или иной группы ДНК на основе его интенсивности. Из-за его положительного заряда, использование EtBr снижает скорость миграции ДНК на 15%. EtBr является подозреваемым мутагенным и канцерогенным, поэтому нужно проявлять осторожность при обращении с агарозном гелей, содержащих его. Кроме того, EtBr считается опасным отходам и должны быть утилизированы надлежащим образом. Альтернативные пятна ДНК в агарозном геле включает SYBR золото, SYBR зеленый, фиолетовый кристалл и метил синий. Из нихМетил синий и фиолетовый кристалл не требует воздействия геля к ультрафиолетовому излучению для визуализации ДНК групп, тем самым снижая вероятность мутации, если восстановление фрагмента ДНК из геля требуется. Однако их чувствительность ниже, чем у EtBr. SYBR золота и SYBR зеленый являются высокочувствительными, УФ-зависимый красители с более низкой токсичностью, чем EtBr, но они значительно дороже. Более того, все альтернативные красители или не может быть или не работают хорошо, когда добавляются непосредственно в гель, поэтому гель должны быть сообщение окрашенных после электрофореза. Поскольку стоимость, простота использования, и чувствительность, EtBr остается краска для многих исследователей. Тем не менее, в определенных ситуациях, например, при утилизации опасных отходов затруднено или когда молодые студенты выполняют эксперимент, менее токсичных красителей может быть предпочтительным.
Загрузка красителей, используемых в гель-электрофореза преследуют три основные цели. Сначала они добавляют плотность образца, Что позволяет ему погружаться в гель. Во-вторых, красителей обеспечивает цвет и упрощения процесса загрузки. Наконец, красители двигаться по стандартным ставкам, через гель, что позволяет для оценки расстояния, что фрагменты ДНК были перенесены.
Точные размеры отдельных фрагментов ДНК может быть определена путем построения журнала молекулярного веса для различных групп ДНК стандарт, по расстоянию от каждой полосы. ДНК стандарт содержит смесь фрагментов ДНК заранее определенного размера, который можно сравнить с неизвестных образцов ДНК. Важно отметить, что различные формы ДНК перемещаться по гель с различными скоростями. Суперспиральная плазмидной ДНК, благодаря своей компактной конформации, проходит через гель быстрее, а затем линейный фрагмент ДНК одного и того же размера, с открытой круглой формы путешествий медленный.
В заключение, после принятия агарозном геле в 1970-х годов для разделения ДНК, она имеетоказался одним из самых полезных и универсальных методов в биологические исследования науки.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne Incorporated | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd, (2001).
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
- Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. , Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).
