Summary
En grundläggande protokollet för separation av DNA-fragment med användning av agarosgel-elektrofores beskrivs.
Abstract
Agarosgelelektrofores är det mest effektiva sättet att separera DNA-fragment av varierande storlek som sträcker sig från 100 bp till 25 kb 1. Agaros isoleras från tång släktena Gelidium och Gracilaria, och består av upprepade agarobiose (L-och D-galaktos) subenheter 2. Under gelatinering, agaros polymerer associera icke-kovalent och bildar ett nätverk av buntar vars porstorlekar bestämma en gelens molekylsiktning egenskaper. Användning av agarosgelelektrofores revolutionerat separation av DNA. Innan antagandet av agarosgel, DNA främst separeras med sukros densitetsgradientcentrifugering, vilket bara gav en approximation av storlek. Att separera DNA med användning av agarosgel-elektrofores, är det DNA laddas in förtillverkade brunnar i gelén och en ström som påläggs. Fosfatryggraden i DNA (och RNA)-molekyl är negativt laddad, därför när den placeras i ett elektriskt fält, kommer DNA-fragment migrerar till positively laddade anoden. Eftersom DNA har en likformig massa / laddningsförhållande, är DNA-molekyler separeras med storlek inom ett agaros-gel i ett sådant mönster att det avstånd som tillryggalagts är omvänt proportionell mot logaritmen för molekylvikten 3. Den ledande modell för DNA-rörelsen genom en agaros-gel "förspänd reptation", varvid den främre kanten rör sig framåt och drar resten av molekylen längs 4. Graden av migration av en DNA-molekyl genom en gel bestäms av följande: 1) storleken på DNA-molekylen, 2) agaros koncentration, 3) DNA konformation 5, 4) spänning, 5) Förekomsten av etidiumbromid, 6) typ av agaros och 7) elektroforesbuffert. Efter separation kan DNA-molekylerna vara visualiserades under UV-ljus efter färgning med ett lämpligt färgämne. Genom att följa detta protokoll ska studenten kunna:
- Förstå den mekanism med vilken DNA-fragmenten separeras i en gelmatris
- Förstå hur konformationen avDNA-molekylen avgör dess rörlighet genom en gelmatris
- Identifiera en agaros-lösning med lämplig koncentration för deras behov
- Framställa en agarosgel för elektrofores av DNA-prover
- Sätt upp utrustningen gelelektrofores och strömförsörjning
- Välja en lämplig spänning för separation av DNA-fragment
- Förstå den mekanism med vilken etidiumbromid medger visualisering av DNA-band
- Bestäm storleken på separerade DNA-fragment
Protocol
1. Framställning av den gel
- Väg in en lämplig massa agaros i en Erlenmeyerkolv. Agarosgeler framställs genom användning av aw / v andel lösning. Koncentrationen av agaros i en gel kommer att bero på storleken hos de DNA-fragment som skall separeras, och de flesta geler som varierar mellan 0,5% -2%. Volymen hos bufferten bör inte vara större än 1/3 av kapaciteten hos kolven.
- Lägg kömingsbuffert till agaros som innehåller kolv. Swirl att blanda. Den vanligaste gelén körs buffertar är TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) och TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA).
- Smältning av agarosen / buffertblandning. Detta är oftast sker genom upphettning i en mikrovågsugn, men kan även ske över en Bunsen-flamma. Vid 30 s intervaller, Ta kolven och virvla innehållet blandas väl. Upprepa tills agarosen är helt upplöst.
- Tillsätt etidiumbromid (EtBr) till en koncentration av 0,5 | ig / ml. Alternativt kan gelén även färgas efter elektrophoresis i rinnande buffert innehållande 0,5 | ig / ml EtBr under 15-30 min, följt av avfärgning i rinnande buffert för en lika lång tid.
Obs: EtBr är en misstänkt cancerframkallande och måste kasseras per institution regler. Handskar ska alltid användas vid hantering av geler som innehåller EtBr. Alternativa färgämnen för färgning av DNA finns, men EtBr fortfarande den mest populära på grund av dess känslighet och kostnad.
- Tillåta agaros svalna antingen på bänken eller genom inkubation i en 65 ° C vattenbad. Underlåtenhet att göra detta kommer tänja gelen facket.
- Placera gelen magasinet i gjutanordningen. Alternativt kan ett band också de öppna kanterna av en gel bricka för att skapa en gjutform. Placera en lämplig kam i gelform för att skapa brunnarna.
- Häll den smälta agarosen i gelform. Tillåta agaros sätts till rumstemperatur. Ta bort kammen och placera gel i gelboxen. Alternativt, gel kan också förpackas i plastfolie och lagrades vid 4 ° C fram till användning (fig 1).
2. Inrättande av Gel Apparater och separation av DNA-fragment
- Tillsätt laddningsfärgämne till DNA-prover som skall separeras (fig. 2). Gelpåföringsfärgämne görs typiskt vid 6X koncentration (0,25% bromfenolblått, 0,25% xylencyanol, 30% glycerol). Laddningsfärg hjälper till att spåra hur långt din DNA-prov har rest, och tillåter också provet att sjunka in i gelén.
- Programmera strömförsörjningen till önskad spänning (1-5V/cm mellan elektroderna).
- Tillsätt tillräckligt rinnande buffert för att täcka ytan av gelén. Det är viktigt att använda samma rinnande buffert som den som användes för att framställa gelén.
- Fäst ledningarna för gelboxen till elnätet. Slå på strömmen och kontrollera att både gel rutan och strömförsörjningen fungerar.
- Ta bort locket. Långsamtoch noggrant läsa DNA-provet (er) in i gelén (figur 3). En lämplig DNA-storleksmarkör ska lastas tillsammans med de experimentella proverna.
- På locket till gelén lådan. Katoden (svarta ledningar) bör vara närmare brunnarna än anoden (röda leder). Dubbelkolla att elektroderna är anslutna till rätt spår i strömförsörjningen.
- Slå på strömmen. Köra gelén tills färgämnet har migrerat till ett lämpligt avstånd.
3. Observera separerade DNA-fragmenten
- När elektrofores är klar, stäng av strömmen och ta bort locket till gelboxen.
- Ta gel från gelboxen. Dränera av överskottsvatten buffert från ytan av gelén. Placera gelen facket på hushållspapper för att absorbera extra kör buffert.
- Avlägsna gelén från gelén brickan och exponera gelén för UV-ljus. Detta är vanligast sker genom ett system gel dokumentation (Fig. 4). DNA-banden ska visaupp som orangefärgade fluorescerande band. Ta en bild av gelen (Fig. 5).
- Kassera i gelen och kör buffert per institution regler.
4. Representativa resultat
Figur 5 visar en typisk följd efter agarosgelelektrofores av PCR-produkter. Efter separation de resulterande DNA-fragmenten är synlig som klart definierade band. Den DNA-standard eller stegen skall separeras till en grad som möjliggör användbara bestämning av storleken av provet band. I det visade exemplet, är DNA-fragment av 765 bp, 880 bp och 1022 bp separerades på en 1,5% agarosgel tillsammans med ett 2-log DNA-stege.
Figur 1. En stelnad agarosgel efter avlägsnande av kammen.
Figur 2. En student lägga laddningsfärg till hennes DNA-prover.
Figur 3. Student laddning av DNA-provet i en brunn i gelén.
Figur 4. Ett exempel på en gel dokumentationssystem.
Figur 5. En bild av en gel efter elektrofores. EtBr sattes till gelén före elektrofores på en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml, följt av separation vid 100 V under 1 timme. Gelén exponerades för UV-ljus och bilden tagen med en gel dokumentationssystem.
Discussion
Agarosgel-elektrofores har visat sig vara en effektiv och effektivt sätt att separera nukleinsyror. Agaros s hög geistyrka möjliggör hantering av låga procentandelar geler för separation av stora DNA-fragment. Molekylsiktning bestäms av storleken på porerna som genereras av buntar av agaros 7 i gelmatrisen. I allmänhet gäller att ju högre koncentration av agaros, desto mindre porstorlek. Traditionella agarosgeler är mest effektiva vid separation av DNA-fragment mellan 100 bp och 25 kb. Att separera DNA-fragment större än 25 kb, kommer man att behöva använda pulsen elektrofores fält gel 6, vilket innefattar applicering av växelström från två olika riktningar. På så sätt större storlek DNA-fragment separeras genom den hastighet med vilken de omorientera sig med de förändringar i nuvarande riktning. DNA-fragment mindre än 100 bp mer effektivt separeras med användning av polyakrylamidgelelektrofores. Skillnadagarosgeler är polyakrylamidgel matrisen bildas genom en fri radikal drivna kemisk reaktion. Dessa tunnare geler är av högre koncentration, drivs vertikalt och har bättre upplösning. I modern DNA-sekvensering kapillärelektrofores används, varigenom kapillärrör är fyllda med en gelmatris. Användning av kapillärrör medger applicering av höga spänningar, vilket därigenom möjliggör separation av DNA-fragment (och bestämning av DNA-sekvensen) snabbt.
Agaros kan modifieras för att skapa låg smältpunkt agaros via hydroxietylering. Lågsmältande agaros används vanligen när isoleringen av separerade DNA-fragment önskas. Hydroxietylering minskar packningstäthet av agaros buntar, vilket effektivt minskar deras porstorlek 8. Detta innebär att ett DNA-fragment med samma storlek kommer att ta längre tid att förflytta sig genom en agarosgel med låg smältpunkt i motsats till en standard-agarosgel. Eftersom buntarna associera med varandragenom icke-kovalenta interaktioner 9, är det möjligt att åter-smälta en agarosgel efter att den har ställts in.
EtBr är den vanligaste använda reagenset för att färga DNA i agarosgeler 10. När de utsätts för UV-ljus är elektroner i den aromatiska ringen i etidium molekylen aktiveras, vilket leder till frisättning av energi (ljus) som elektroner återgång till grundtillståndet. EtBr verkar genom inskjutande sig i DNA-molekylen i en koncentrationsberoende sätt. Detta medger en uppskattning av mängden DNA i en viss DNA-band baserat på dess intensitet. På grund av sin positiva laddning, minskar användningen av EtBr hastigheten DNA migration med 15%. EtBr är en misstänkt mutagent och cancerframkallande, därför måste man iaktta försiktighet vid hantering av agarosgeler som innehåller det. Dessutom är EtBr betraktas som farligt avfall och måste tas om hand på lämpligt sätt. Alternativa fläckar för DNA i agarosgeler inkluderar SYBR Gold, SYBR grön, Crystal Violet och metyl Blue. Av dessaMetyl Blue och kristallviolett kräver inte exponering av gelén för UV-ljus för visualisering av DNA-band, vilket minskar sannolikheten för mutation om återvinning av DNA-fragmentet från gelén önskas. Emellertid deras känslighet är lägre än den för EtBr. SYBR guld och SYBR gröna är båda mycket känsliga och UV beroende färgämnen med lägre toxicitet än EtBr, men de är betydligt dyrare. Dessutom är alla de alternativa färgämnen antingen inte kan vara eller inte fungerar bra vid tillsats direkt till gelén, varför gelén måste vara post färgades efter elektrofores. På grund av kostnader, användarvänlighet, och känslighet förblir EtBr fortfarande färgämnet i valet för många forskare. Dock i vissa situationer, exempelvis när farligt avfall är svår eller när unga studenter utför ett experiment, kan en mindre giftiga färgämnen att föredra.
Lastning färgämnen som används i gel-elektrofores tjäna tre huvudsyften. Först lägger densitet på provet, Så att den kan sjunka in i gelén. För det andra färgämnen ge färg och förenkla lastning. Slutligen färgämnen rör sig standardpriser genom gelén, vilket för uppskattning av avståndet att DNA-fragment har migrerat.
De exakta storlekar av separerade DNA-fragment kan bestämmas genom plottning av logaritmen av molekylvikten för de olika banden av en DNA-standard mot avståndet som tillryggalagts av varje band. Den DNA-standard innehåller en blandning av DNA-fragment av förutbestämda storlekar som kan jämföras mot de okända DNA-prover. Det är viktigt att notera att olika former av DNA röra sig genom gelén vid olika hastigheter. Superspiralvriden plasmid-DNA, på grund av dess kompakta konformation, rör sig genom gelén snabbast, åtföljt av en linjär DNA-fragment av samma storlek, med den öppna cirkulära formen färdas den långsammaste.
Sammanfattningsvis, då det att agarosgeler under 1970 för separation av DNA, har detvisat sig vara en av de mest användbara och mångsidiga tekniker i biologi forskning.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne Incorporated | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd, (2001).
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
- Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. , Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).
