Ufikserede frosne vævsprøver indlagt i Optimal Cutting Temperatur medium (OCT) kan anvendes til undersøgelse af naturlige fordeling og glycosylering af secerneret slim. I denne tilgang vævsbehandling er minimal, og den naturlige præsentation af glycolipider, muciner og glycan-epitoper er bevaret. Vævssnit kan analyseres ved immunohistokemi ved anvendelse af fluorescens eller kromogen detektion.
Muciner er komplekse og stærkt glycosyleret O-bundne glycoproteiner, som indeholder mere end 70% carbohydrat vægt 1-3. Secernerede muciner, produceret af slimceller og maveslimhinden, giver stilladset en mikrometer tykt slimlag at linjer epiteler i tarmen og luftvejene 3,4. Ud over muciner, også slim lag indeholder antimikrobielle peptider, cytokiner og immunglobuliner 5-9. Det slim lag er en vigtig del af vært medfødte immunitet, og danner den første linje i forsvaret mod invaderende mikroorganismer 8,10-12. Som sådan er slim genstand for talrige interaktioner med mikroorganismer, både bakterier og symbionter, og secernerede muciner danner en vigtig grænseflade for disse interaktioner. Undersøgelsen af sådanne biologiske vekselvirkninger involverer sædvanligvis histologiske metoder til vævs indsamling og farvning. De to mest almindeligt anvendte histologiske metoder til væv indsamling og preservtion i klinikken og i forskningslaboratorier er: formalinfiksering efterfulgt af paraffin embedding, og væv frysning, efterfulgt af indstøbning i kryo-beskyttelsesmiddel medier.
Paraffinindlejrede vævsprøver producere sektioner med optimale egenskaber til histologisk visualisering, herunder klarhed og veldefineret morfologi. Men i løbet af paraffin indlejring er en række epitoper er blevet ændret, og for at studere disse epitoper, vævssnittene skal bearbejdes yderligere med en af mange epitopgenfinding metoder 13. Secernerede muciner og lipider ekstraheres fra vævet i paraffin-indlejring clearing trin, som kræver forlænge inkubation med organiske opløsningsmidler (xylen eller Citrisolv). En sådan fremgangsmåde er optimal for undersøgelser, der fokuserer på arten og fordelingen af muciner og slim in vivo.
I modsætning hertil indlejring fryse væv i Optimal Cutting Temperatur (OLT) medium enhulrum dehydrering og clearing af prøven og opretholder prøven hydrering. Dette giver mulighed for bedre bevarelse af hydratiseret mucuslaget, og således tillader studiet af de mange roller muciner i epitel biologi. Da denne fremgangsmåde kræver minimal forarbejdning af vævet er vævet opbevares i en mere naturlig tilstand. Derfor frosne væv sektioner kræver ikke yderligere forarbejdning før farvning og kan let analyseres ved hjælp af immunhistokemi metoder.
Vi viser bevarelsen af mikrometer tykt udskilte slim lag i frosne kolon prøver. Dette lag reduceres drastisk i de samme væv indlejret i paraffin. Vi viser også immunfluorescensfarvning af glycan epitoper præsenteret på muciner hjælp plante lectiner. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at den ikke kræver anvendelse af specielle fiksativer og tillader anvendelse af frosne væv, der allerede kan være konserveret i laboratoriet.
Bevarelse af slim og glycan epitoper i frosne væv er overlegen i forhold til væv, som blev indlejret i paraffin. Vi viste bevarelse af secerneret mucuslaget (figur 1 og 3), og fordelingen af tre glycans strukturer (fig. 3) i frosne væv sammenlignet med paraffinindlejrede væv. Specialiserede fiksativer, såsom Carnoy opløsning (60% ethanol, 30% chloroform, 10% eddikesyre) 17 er blevet udviklet til optimal bevaring af slimlaget i vævsprøver. Optimalt set bør denne opløsning anvendes til at opsamle vævsprøver, der er dedikeret til slim undersøgelser og blev vist at opretholde et effektivt udseende af mucuslaget 16-17. Det slim lag i ufikserede frosne prøver indlejret i OCT forekommer robust og i nogle områder kan løsnes fra vævet, men den samlede lagtykkelse er indforstået med, der blev observeret i væv, der blev fastsat med Carnoy opløsning og embedded i paraffin 16-17. For eksempel er slimlaget i frosset human colon vævssnit ~ 100 um (fig. 1), hvilket er inden for det område rapporteret for Carnoy's-fikseret human colon prøve 55,4 ± 2,5 um (intervallet fra 7,7 til 204,8 um) 16.
Det har været kendt i årtier, at ethanol dehydrering resulterer i ~ 30% krympning af biologiske prøver 18, og at organiske opløsningsmidler, såsom xylen, Citrisolv og chloroformekstrakten lipider, glycolipider og i en vis udstrækning, proteiner fra vævene 13. Vævsbehandling for paraffin indlejring omfatter følgende trin: fiksering (10% pufret formalin), dehydrering (stigende ethanolkoncentration) og clearing (Citrisolv eller xylen). Ved at efterligne disse trin på ikke-fikserede frosne vævssektioner demonstrerede vi, at Citrisolv udtrækker slim fra frosne vævssektioner resulterer i vævsmorfologi, der ligner den af paraffinindlejrede væv (Figure 2, højre panel). I modsætning hertil blev slimlaget ikke ændret ved inkubation med formalin eller ethanol (figur 2, venstre og midterste paneler). Dette antyder, at clearing trinnet standard paraffin embedding procedure, som kræver forlænget inkubering i Citrisolv / xylen, resulterer i sammenbrud af mucuslaget. Formalinfiksering skader ikke slim lag og frosne væv sektioner, som blev fikseret med formalin kan let farvet med lectiner og antistoffer mod glycans, glycolipider og proteiner (figur 2, 3 og 6). Disse virkninger kan være ubetydelige til undersøgelse af membranbundne proteiner og vævs patologi, men de er ødelæggende for stærkt hydratiserede strukturer som det secernerede slimlag. Imidlertid histologiske undersøgelser af muciner stadig udføres mest med paraffinindlejrede prøver, hvor slimlaget konservering er suboptimal. Dybdegående analyser af mucuslaget sammensætning, såsom den nøjagtige identitet af secreted eller membranbundne MUC glycoprotein kombinationer kræver specifikke antistoffer og massespektrometri til identifikation af protein backbone-net. Konservering af slim lag er, men den indledende krav til sådanne undersøgelser.
Mange laboratorier har vævsprøver indefrosset i OCT, der blev indsamlet i fortiden til forskellige projekter, kan disse væv let bruges til at undersøge muciner, glycolipider og glycan fordeling eliminerer behovet for at indsamle væv i særlige fiksativer, der er designet unikt for slim konservering. Frosne væv undergår minimal forarbejdning og derfor den naturlige fordeling af glycaner, som er hydratiseret karakter, bevares. Dette er især vigtigt i realm af mikrobielle vært interaktioner. Viden om naturalistiske udbredelse og talrighed secernerede muciner og de mange glycan strukturer udsmykning disse "barriere" molekyler vil være afgørende i forståelsen vært forsvar, mikrobiel udnyttelse og patogenerer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Nicole M. Nemeth (University of Georgia) og Jeanne M. Fair (LANL) for deres hjælp i høst kylling væv, og Steven A. Springer for hans hjælp under optagelserne. Pasning af alle fugle i denne undersøgelse var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer for human brug af forsøgsdyr, og alle protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug udvalgene på Los Alamos National Security, LLC, operatøren af Los Alamos National Laboratory under kontrakt nr. DE-AC52-06NA25396 med det amerikanske Department of Energy. Pasning af mus i denne undersøgelse er i overensstemmelse med UCSD dyr godkendte protokol. Humane væv blev opnået som en del af UCSD godkendt IRB protokol. Dette arbejde blev støttet af tilskud 118.645 fra University of California Lab Fee President Program (PG) og tilskud NS047101 fra National Institute of Neurologiske og Stroke (Neuroscience Microscopy Delt Facility, UC San Diego).
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |