Summary
דגימות רקמה קפוא מבולבלות גלומות במדיום טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר) יכולות לשמש כדי לחקור הפצה וglycosylation טבעית של ריר מופרש. בעיבוד רקמות גישה זו היא מינימאלי והמצגת הטבעית של גליקוליפידים, mucins וglycan-אפיטופים נשמרה. סעיפי רקמות יכולים להיות מנותחים על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות זיהוי פלואורסצנטי או chromogenic.
Abstract
Mucins הם גליקופרוטאינים O צמודים מורכבים וכבדות מסוכרת, המכילים פחמימות יותר מ 70% ממשקל 1-3. mucins המופרש, המיוצר על ידי תאי גביע ורירית הקיבה, מספק פיגום לשכבת ריר מיקרומטרים בעובי שקווי epithelia של המעיים ומערכת נשימת 3,4. בנוסף לmucins, שכבות ריר מכילות גם פפטידים מיקרוביאלית, הציטוקינים ונוגדנים 5-9. שכבת הריר היא חלק חשוב מחסינות מולדת מארח, ומהווה את קו ההגנה הראשון נגד פולשי מיקרואורגניזמים 8,10-12. ככזה, הליחה כפופה לאינטראקציות רבות עם חיידקים, שני פתוגנים וsymbionts וmucins המופרש יוצרים ממשק חשוב לאינטראקציות אלה. המחקר של אינטראקציות ביולוגיות כאלה בדרך כלל שיטות היסטולוגית לאיסוף רקמות וכתמים. שתי השיטות הנפוצות ביותר היסטולוגית לאיסוף רקמות וpreservation במרפאת ובמעבדות מחקר הוא: קיבוע פורמלין ואחרי הטבעת פרפין, והקפאת רקמות, ואחרי ההטבעה בתקשורת cryo-protectant.
דגימות רקמת פרפין המוטבע בייצור חלקים עם תכונות אופטימליות להדמיה היסטולוגית כולל בהירות ומורפולוגיה מוגדרת היטב. עם זאת, במהלך תהליך הטבעת פרפין מספר אפיטופים הפך שונה וכדי ללמוד אפיטופים אלה, חלקי רקמה צריכים להיות מעובד נוסף עם אחד משיטות יחזרו epitope רבות 13. mucins ושומנים מופרשים מופקים מהרקמות במהלך צעד סליקת פרפין ההטבעה, הדורש להאריך דגירה עם ממסים אורגניים (קסילן או Citrisolv). לכן גישה זו היא תת אופטימלית למחקרים שהתמקדו בטבע וההפצה של mucins וליחה בגוף חי.
לעומת זאת, רקמות הקפאה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) הטבעה בינוניתחללי התייבשות וסליקה של המדגם, ושומר על לחות המדגם. זה מאפשר לשימור טוב יותר של שכבת ריר ההתייבשות, ובכך מאפשר הלימוד של התפקידים הרבים של mucins בביולוגית אפיתל. מאחר שהשיטה זאת דורשת עיבוד מינימאלי של הרקמה, הרקמה נשמרה במצבו טבעי יותר. סעיפי רקמות קפואות לכן אינם דורשים כל טיפול נוסף, לפני הצביעה ויכולים בקלות להיות מנותח באמצעות שיטות אימונוהיסטוכימיה.
אנחנו מדגימים שימור שכבת ריר מיקרומטרים בעובי מופרש במעי גס בדגימות מוקפאות. שכבה זו היא באופן דרסטי כאשר אותם רקמות מוטבעות בפרפין. אנחנו גם מדגימים מכתימים immunofluorescence של אפיטופים glycan הוצגו על mucins באמצעות קטיני צמח. היתרון של גישה זו הוא שהיא אינה דורשת את השימוש בfixatives המיוחד ומאפשרת ניצול רקמות קפואות שעשויות להיות כבר נשתמרו במעבדה.
Protocol
1. הטבעת רקמה באוקטובר
- הכן אמבטית הקפאה על ידי הוספת קרח יבש לוטאן 2-מתיל בקופסא קלקר רדודה.
- לקצור את הרקמות, ועדינות לחה על נייר טישו לייבוש נוזלים עודפים. אם משתמש ברקמות Snap-קפוא (רקמה שהוקפאה בחנקן נוזלי), יש לאפשר לרקמות לחמם עד -20 ° C על ידי הצבתו בתא cryo-microtome.
- הוסף כמות קטנה של אוקטובר לעובש הקפאת פיל-A-Way, רק כדי לכסות את תחתית התבנית.
- הנח את הרקמה בעובש, ודא הרקמה נחה על קרקעית התבנית בכיוון הרצוי. קפוא פעם, בלוק הרקמה יהיה נותח או מלמטה או מהצדדים.
- כסה את הרקמה באוקטובר, ואת מקום העובש באמבטית ההקפאה. מתחם אוקטובר יהפוך לבן כמו הרקמה קופאת.
- ברגע קפוא, קליפת העובש מעל הבלוק והמקום הקפוא בשקית הקפאה ניכרת.
- אובניים הקפוא יכול להישמרב-80 ° C עד שימוש.
2. רקמת קטגוריות קיימת
- אובניים מקום רקמות בתא cryo-microtome, ומאפשר להם להגיע ל-20 ° C (כ 30 דקות).
- חותך מקטע עבה 3-5 מיקרומטר, ולמקם את שקופית זכוכית טעונה חיובי בחלק העליון של הסעיף. הרקמה תדבק בשקופית.
- האוויר לייבש את הרקמות ל30-60 דקות.
- את השקופיות ניתן להשתמש בשלב זה, או שהם יכולים להיות כל זמן ב-80 ° C לשימוש עתידי.
3. כתמי רקמה
- שקופיות שאוחסנו ב-80 ° C: לאפשר את השקופיות שתפשרנה ואוויר יבשים בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
- תקנו את השקופיות עם 10% שנאגרו פורמלין למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף שלוש פעמים ב PBS או בולם TBST, לכל שטיפה לטבול את השקופיות 10 פעמים במאגר 250 מ"ל. PBS חיץ יכול לשמש לצביעת immunofluorescence, עם זאת, לגילוי chromogenic עם phosphatase-conjug אלקלייןated נוגדן, TBST יש להשתמש מאז פוספט ב PBS מעכב פעילות phosphatase אלקליין.
- שקופיות חתכי רקמה מוכנות כעת להיות מוכתם.
4. שימוש בכתמי Histochemical כגון Alcian כחול ושייף חומצה תקופתית לזיהוי ריר
- Alcian כתם כחול:
- שטוף את השקופיות במים, דגירה בחומצה אצטית 3% עבור 3 דקות בטמפרטורת חדר.
- כתם עם 2.5 פתרון pH הכחול Alcian למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- שטוף את השקופיות בניהול מים ברז למשך 10 דקות, לשטוף במי DI.
- Counterstain באדום מהיר גרעיני למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים במי DI.
- שיף חומצה התקופתית כתם:
- שטוף את השקופיות במים, בדגירת חומצה תקופתית 1% מוכנים טרי למשך 5 דקות.
- לשטוף שלוש פעמים במי DI, לטבול פעם אחת במי miliQ.
- כתם עם ריאגנט שייף במשך 15 דקות בחדר temperaturדואר.
- שטוף את השקופיות בניהול מים ברז למשך 10 דקות, לשטוף במי DI.
- Counterstain בSurgipath Hematoxylin למשך 30 שניות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים במי DI.
- דגירת שקופיות 30 שניות במים ברזו של סקוט בטמפרטורת חדר.
- לשטוף שלוש פעמים במי DI.
- לייבש ולנקות שקופיות על ידי דוגר דקות 1 באתנול 95%, ואחריו שלושה שינויים מהירים באתנול 100%, ושלושה שינויים בCitrisolv, 2 דקות כל אחד. הכל בטמפרטורת חדר.
- הר שקופיות על coverslips עם מדיום שרף (Cytoseal 60).
5. שימוש בקטינים ונוגדנים (טבלה 1) לזיהוי אפיטופים glycan ידי שיטות Histochemical
- לגילוי קרינה של 3 אפיטופים glycan באמצעות קטינים, חסום את השקופיות עם BSA 1% בPBS עבור 10-30 דקות בטמפרטורת חדר.
- מאז קטין biotinylated משמש, לחסום יוטין אנדוגני ידי דוגר 15 דקות עם 0.1%Avidin, ואחרי דגירת 15 דקות עם ביוטין 0.01% בטמפרטורת חדר.
- שטוף את השקופיות בPBS לאחר כל שלב חסימה.
- טרי להכין תערובת של מיקרוגרם / מ"ל ניבט חיטת agglutinin 1 rhodamine מצומדות succinylated (sWGA), מיקרוגרם / מ"ל biotinylated Sambucus nigra agglutinin 1.3 (SNA) ו 5 מיקרוגרם / המ"ל Jacalin fluorescein מצומדות בHEPES / NaCl חיץ (10 HEPES מ"מ, 150 mM NaCl pH 7.5).
- שקופיות על גבי משטח שטוח או בתיבה מכתימה, ושכבת תערובת הקטין על העליונה. נפח התערובת יכול להיות מופחת על ידי נחת parafilm עדינות על הנוזל, parafilm משטח את הנוזל ומונע אידוי.
- דגירת 1 שעה בטמפרטורת חדר בחושך.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם PBS.
- שקופיות שכבה עם 0.7 מיקרוגרם / מ"ל streptavidin מצומדות CY5 (כדי לזהות-SNA biotinylated), ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם PBS.
- Counterstain גרעינים עם 0.1 & Mu; גרם / המ"ל DAPI.
- הר שקופיות על coverslips עם מדיום כגון תקשורת הרכבת VectaMount (או כל מדיה מימית) מימי.
6. שליטה על כתמים ספציפיים קטין
- הספציפיות מכתימות קטין נמצאים בשליטה או על ידי מחשוף האנזימטית ספציפי של היעד glycan epitope לפני הצביעה או על ידי תחרות עם מולקולות קטנות.
- מחשוף האנזימטית לSambucus nigra agglutinin (SNA) הסגולית מחייב
- דלל Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS) עד 250 MU / מ"ל בחומציות 50 mM נתרן יצטט 5.5.
- מוסיף מים עד לתחתית קצה קופסה ריקה, זה יהיה בצורת תא לח במהלך דגירה.
- שקופיות מקום להתמודד על המגש העליון של קצה-תיבת הפתרון, שכבת 150-200 μl AUS בשקופית והכיסוי עם coverslip. הימנע מהיווצרות בועות אוויר.
- סגור את מכסה הקופסה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים ב PBS ברוח חדרשבמקום כדי להסיר את כל חומצות sialic בחינם. שקופיות אלה צריכות להיות שליליות עבור מכתימות SNA.
- מעכבים תחרותיים עבור Jacalin וניבטו חיטה סגולית succinylated agglutinin (sWGA)
- 200 μl aliquot של תערובת הקטין מוכן בשלב 5.4 לשני בקבוקוני Eppendorf.
- הוסף 200 המ"מ Melibiose (מעכב Jacalin) לאחד מהבקבוקונים וכיטין-hydrolyzate בדילול 01:10 (sWGA מעכב) לבקבוקון האחר.
- שקופיות בקרה שליליות ריבוד עם מעכבים המכילים תערובת ו1 שעה לדגור בטמפרטורת חדר באותו הזמן כמו שאר השקופיות. שקופיות אלה צריכות להיות שליליות עבור Jacalin או כתמי sWGA, בהתאמה.
7. נציג תוצאות
השוואה בין דגימות רקמה משובצת בפרפין לרקמות קפוא משובצות בתקשורת cryo-protectant (אוקטובר) חשפה הבדל בולט בשימור ואיכות ההכתמה לmuciגליקופרוטאינים n. צביעת רקמות בצבעי histochemical, כגון Alcian כחול ושייף חומצה תקופתית, להפיק תוצאות שונות מאוד בחלקי רקמה דומים מדוגמאות משובצות קפואות או פרפין (איור 1). נראה כי ממס אורגני (קסילן או Citrisolv) המשמש בתהליך הטבעת פרפין משפיע על ההתפלגות של mucins מופרש על epithelia כמו גם הסרה הרבה מגליקוליפידים מהדגימות (איור 2). כתוצאה מכך, שכבת הריר מופיעה התמוטטה על תאי רירית ובעיקר מצא בתאי גביע. הקפאת הבזק של רקמות בתקשורת cryo-protectant (אוקטובר) שמרה על הידרציה מדגם ושמרה את ממדי שכבת mucins המופרשים. תהליך הטבעת פרפין מושפע glycans ריר הקשורים אחר וגליקוליפידים בדרך דומה. הפצת glycan נבדקה באמצעות לקטינים, המשמשים באופן שגרתי לגילוי glycan (איור 3) ונוגדנים כנגד אפיטופים שנמצאו עלmucins וגליקוליפידים (איור 6). בגלל מחייב קטין אינו מוגדר היטב והוא מושפע מהפיזור המרחבי של glycans כמו גם מבנה glycan 14,15, חשוב ליישם את הבקרות המתאימות לצביעת קטין. כאן אנו מדגימים שתי שיטות לשליטה בהכתמת קטין על הרקמות שנבדקו: ביקוע אנזימטי ועיכוב תחרותי. מחשוף של אפיטופים glycan נעשה על ידי לעכל את קטע הרקמה עם אנזימי glycan ספציפיים, למשל sialidase חיידקים כשליטה לחומצה מחייבת ידי SNA (איור 4) sialic. במקרים בם אנזים מסוים (למשל glycosidase) אינו זמין להסרת glycan epitope למד, סגולי קטין שניתן לאשר על ידי הוספת מעכב תחרותי כגון Melibiose להכתמת Jacalin או כיטין-hydrolyzate להכתמת sWGA (איור 5).
אנו מראים כאן שדגימות רקמה נצמדת קפואות, שהם Rouהושג tinely במרפאת ובמעבדות מחקר, יכול להיות מוטבע נוסף באוקטובר ומשמש ללמוד גליקופרוטאינים mucin וglycans הנוכחי עליהם רב.
| קטין / Ab | מקור | סגולי גדול |
| LFA | Limax flavus (קליע צהוב) | המסוף Sia |
| * מאא | Maackia amurensis (אמאר Maackia) | Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-סולפט בGalβ1-R |
| SNA | Sambucus nigra (סמבוק) | Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc |
| WGA | Triticum vulgaris (ניבט חיטה) | GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia |
| sWGA | vulgaris Triticum Succinylated (ניבט חיטה) | GlcNAc & bETA; 1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc |
| PNA | Arachis hypogaea (בוטנים) | Galβ1-3GalNAc (ללא שינוי T-אנטיגן) |
| Jacalin | Artocarpus integrifolia (Jacalin) | Galβ1-3GalNAc מצא בglycans O הצמוד |
| ECA | Erythrina cristagalli (עץ אלמוג) | Galβ1-4GlcNAc |
| TKH2 | נוגדן | Siaa2-6GalNAc (STN) על glycans O הצמוד |
| CA19-9 | נוגדן | Siaa2-3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (לופוס) |
| SNH3 | נוגדן | Siaa2-3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (לופוס x) |
קיצורים: AB, נוגדנים; SIA, חומצת Sialic; גל, גלקטוז; GalNAc,
טבלת 1. רשימה חלקית של קטינים ונוגדנים לאפיטופים glycan.
איור 1. צביעה תקופתית חומצה שייפה של רקמות מעי גס, קפואות ופרפין מוטבעים-. קטעי רקמה, עכבר אנושי או דגימות מעי עוף קפוא באוקטובר (פנל העליון) או מוטבעים בפרפין (פנל תחתון) Alcian הכחול והוכתמו חומצה שייפה תקופתי (PAS) או Alcian הכחול (א.ב.). ריאגנטים אלה כתם ריר ורוד או כחול, בהתאמה. פנל עליון: ברקמות קפואות, בנוסף לmucins בתאי גביע, ריר המופרש היה גם מולניכר בו כלל (חיצים). פנל תחתון: רקמות בפרפין המוטבע-, כתמי ריר היה מרותקים לתאי גביע. גרעינים היו counterstained עם Surgipath (PAS) או (א.ב.) Hematoxylin של המאייר. סרגל קנה מידה מציין 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תוצאות Citrisolv דגירה באובדן משמעותי של mucins. קטעים סידוריים של דגימות אילאום עוף קפואות היו קבועות ב10% נאגרו פורמלין והמשיכו להתייבש (פנל שמאלי), מיובש באתנול על ידי דגירה רציפה ב70%, 90% ו 100% אתנול 20 דקות כל אחד (פנל באמצע), או מיובש באתנול ופינה עם Citrisolv לשעה 1 (לוח ימני). דגימות מיובשות היו rehydrated חזרה לPBS לפני Hematoxylin וEosin (H & E) או הכתמים הכחולים Alcian. התייבשות אתנול וCitrisolv סליקת רקמות מור משופרphology (שורה לדוגמה, למעלה, תמונות בינוניות ונכון מול תמונה משמאל). התייבשות אתנול לא הייתה השפעה משמעותית על כתמים הכחולים Alcian (שורה אמצעית, להשוות תמונות שמאל ואמצע). לעומת זאת, דגירת Citrisolv מופחתת מכתימה הכחול Alcian והגבילה אותו לתאי גביע (שורה אמצעית, תמונה מימין) בדפוס שהיה דומה לזו שראתה ברקמות פרפין מוטבע (תרשים 1). נתונים אלה מרמזים על כך שהכתמים החזקים של גרגרי ריר בדגימות פרפין מוטבעים בשל כיווץ וההצטברות של ליחה בתאי הגביע בשלב הסליקה. החיוור ופחות צפופים המכתים של ריר ברקמות קפואות אוקטובר-משובצת משקף חלוקה טבעית יותר של ריר ברקמות. הגדלה גבוהה יותר של אזורים בארגזים מסומנות בחיצים. ברי קנה מידה מציינים 50 מיקרומטר (שורות עליונות ואמצעיות) ו 10 מיקרומטר (בשורה תחתונה).
איור 3. עקידהקטינים לאפיטופים glycan על רקמות קפואות ופרפין מוטבעים-. עוף מעי (מעי עקום) דגימות קטנות קפואים באוקטובר (פנלים העליונים) או מוטבעים בפרפין (פנלים נמוכים) נבדקו עם Jacalin (כחול), sWGA (ירוק) וSNA (אדום ). הגדלה גבוהה יותר של אזורים בארגזים מסומנות בחיצים. ברקמות קפואות Jacalin מחייב glycans O הצמוד חשף מבנים שהופיעו יתחיל לדלוף מתאי גביע ללום (Jacalin, פנל העליון, חיצים). לעומת זאת, Jacalin המחייב לרקמות פרפין המוטבעים היה מרותק לתאי גביע (Jacalin, פנל תחתון, חיצים) ועד לגבול מברשת villi (תמונה תחתונה משמאל, חץ). מכתים sWGA של β1-4GlcNAc ישתף מקומי באופן חלקי עם הכריכה של קטין Jacalin בשתי הרקמות הקפואות (פנל העליון, חיצים), ובפרפין מוטבע-רקמות (פנל תחתון, חיצים). לעומת זאת, קטין מחייב α2-6 חומצות sialic מקושרים SNA הוא תאי (SNA, ראשי חץ), ולא במשותף עם לוקליזציה-Jacalin (צבעתמונה, SNA באדום מסומן בראש החץ, Jacalin בכחול מסומן בחץ מקווקו). ברי קנה מידה מציינים 100 מיקרומטר (תמונות משמאל) ו20 מיקרומטר (אזורי boxed מוגדל).
איור 4. שליטת אנזימתי מחשוף למכתים החומצה sialic עם SNA. דגימות מעי דק עוף הודגרו עם 250 MU / מיליליטר Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS) או עם 5.5 חיץ 50 mM נתרן יצטט pH עבור 2.5 שעות ב 37 ° C. AUS טיפול מבטל הכתמה עם biotinylated SNA, המאשר את הספציפיות מחייבות SNA לחומצות sialic. סרגל קנה מידה מציין 100 מיקרומטר.
איור 5. שליטה תחרותית לעיכוב מכתים glycan עם Jacalin וsWGA. עוף מעי (מעי עקום) דגימות קטנות הודגרו בתערובת Jacalin וsWGA בנוכחות LEC הספציפימעכבי פח: Melibiose (עמודה אמצעית), כיטין-hydrolyzate (עמודה ימנית) או בלי מעכב (A ו-D). פנל עליון: (משמאל) מכתים Jacalin ללא מעכבים. מכתים (במרכז) Jacalin נבלם על ידי Melibiose. (מימין) כיטין-hydrolyzate לא לעכב מכתים Jacalin. פנל תחתון: (משמאל) מכתים sWGA ללא מעכב. (במרכז) Melibiose לא לעכב מכתים sWGA. (מימין) מכתים sWGA נבלם על ידי כיטין-hydrolyzate. עיכוב זה מאשר את האינטראקציה הספציפית של קטינים עם הרקמות. תמונת כוכביות סימן של עיכוב מכתים. סרגל קנה מידה מציין 100 מיקרומטר.
איור 6. איתור של mucins הפרשה, גליקוליפידים, ואפיטופים glycan ברקמות סרטן מעי גסות אנושיות קפואות. ביופסיות מסרטן המעי גסה וסרטן וילוס קרצינומה רירית היו נצמדים קפואות בחנקן נוזלי ומוטבעים באוקטובר סעיפי רקמות הודגרו ל1 ש 'עם נוגדנים נגד mucin המופרש MUC5AC, sialyl לואיס - glycan epitope מצא בgangliosides (סרטן המעי גס סמן CA 19-9), וsialyl-TN - epitope glycan שפע על mucins (מזוהה עם TKH2 נוגדנים), ואחרי 30 דקות עם דגירה חמור נוגדן biotinylated אנטי עכבר IgG משני, ודגירת 30 דקות עם streptavidin peroxidase מצומדות. רקמות נוספות הודגרו לשעה 1 עם הקטינים SNA biotinylated וsWGA, ואחרי דגירת 30 דקות עם streptavidin peroxidase מצומדות. מכתים peroxidase פותח באמצעות AEC ערכה. סרגל קנה מידה שחור מציין 200 מיקרומטר.
Discussion
שימור אפיטופים ריר וglycan ברקמות קפואות עדיף על זה של רקמות שהוטבעו בפרפין. אנחנו הוכחנו שימור שכבת ריר מופרש (תרשימי 1 ו 3) וההפצה של שלושה מבני glycans (איור 3) ברקמות קפואות לעומת רקמות פרפין מוטבעים. fixatives מיוחד, כגון הפתרון של Carnoy (אתנול 60%, כלורופורם 30%, 10% חומצה אצטית) 17 פותחו לשימור אופטימלי של שכבת הריר בדגימות רקמה. במצב אופטימלי, פתרון זה עשוי לשמש לאיסוף דגימות רקמה שמוקדשות ללימודי ריר והוצג לשמור על המראה התקין של שכבת ריר 16-17. שכבת הריר בדגימות קפואות מבולבלות המוטבעת באוקטובר מופיעה מחוספסת ובאזורים מסוימים עשויה להתנתק מהרקמות, לעומת זאת עובי השכבה הכולל הוא בהסכם עם זה שנצפה ברקמות שהיו קבועים עם הפתרון וembedd של Carnoyאד בפרפין 16-17. לדוגמה, שכבת הריר בסעיף רקמה קפוא מעי גס היא ~ 100 מיקרומטר (איור 1), שנמצא בטווח שדווח למדגם Carnoy's קבוע מעי גס 55.4 ± 2.5 מיקרומטר (טווח 7.7-204.8 מיקרומטר) 16.
זה כבר ידוע במשך עשרות שנים שתוצאות התייבשות אתנול בהצטמקות ~ 30% מדגימות ביולוגיות 18, וכי ממסים אורגניים כגון קסילן, שומנים כלורופורם לחלץ, גליקוליפידים, ובמידה מסוימת, Citrisolv וחלבונים מהרקמות 13. עיבוד רקמות להטבעת פרפין כולל את השלבים הבאים: קיבעון (10% נאגרו פורמלין), התייבשות (ריכוז אתנול הגדלה), וסליקה (Citrisolv או קסילן). על ידי חיקוי הפעולות הבאות על חלקי רקמה קפוא יתבטלו, הראינו כי תמציות Citrisolv ליחה מחלקי רקמה קפוא וכתוצאה ממורפולוגיה רקמה שדומה לזו של רקמות פרפין מוטבע (Figurדואר 2, לוח ימני). בניגוד לכך, שכבת הריר לא שונתה על ידי דגירה עם פורמלין או אתנול (איור 2, שמאל ומרכז פנלים). הדבר מצביע על כך צעד הסליקה של הליך הטבעת פרפין הסטנדרטי, אשר דורש דגירה ממושכת בCitrisolv / קסילן, התוצאות בקריסה של שכבת הריר. קיבעון פורמלין אינו פוגע בחלקי רקמות קפואים ושכבת הריר שהיו קבועים בפורמלין יכול בקלות להיות מוכתם בקטינים ונוגדנים נגד glycans, גליקוליפידים וחלבונים (איורים 2, 3, 6). השפעות אלה עשויות להיות זניחות לחקר חלבוני קרום כפותים ורקמות פתולוגיה, אבל הם הרסניים למבני hydrated מאוד כגון שכבת הריר המופרש. עם זאת מחקרים היסטולוגיים של mucins עדיין מתנהלים בעיקר עם דגימות פרפין מוטבע-, שבו שימור שכבת הריר היא הכי מוצלח. בניתוח מעמיק של הרכב שכבת ריר כגון זהותו המדויקת של seשילובי גליקופרוטאין MUC כפותים creted או קרום דורשים נוגדנים ספציפיים וספקטרומטריית מסות לזיהוי מעמודי תווך החלבון. שימור שכבת הריר הוא אך הדרישה הראשונית ללימודים כאלה.
מעבדות רבות דגימות רקמה קפואה באוקטובר שנגבו בעבר עבור פרויקטים שונים, רקמות אלה יכולות לשמש בקלות ללמוד mucins, גליקוליפידים, והפצת glycan מבטלת את הצורך לאסוף רקמות לתוך fixatives המיוחד המיועדים באופן ייחודי לשימור ריר. רקמות קפואות עוברות עיבוד מינימאלי ולכן החלוקה הטבעית של glycans, שהם hydrated בטבע, נשמרה. זה חשוב במיוחד בתחום של אינטראקציות מיקרוביאלי-מארחת. ידע של הפצה ושפע נטורליסטית של mucins מופרש והרבה מבני glycan לקשט מולקולות אלה "מכשול" יהיה מפתח להבנת הגנה מארחת, ניצול חיידקים וpathogenesהוא.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לניקול מ 'נמט (אוניברסיטת ג'ורג'יה) וז'אן פיר מ' (LANL) על עזר בקצירת רקמות עוף, וסטיבן א פרינגר על עזרתו בזמן צילומים. הטיפול של כל ציפור במחקר זה היה בעמידה במכונים הלאומיים לבריאות הנחיות לשימוש האנושי בחיות מעבדה ואת כל הפרוטוקולים אושרו על ידי טיפול בבעלי החיים וועדות המוסדיים השתמש בלוס אלמוס לביטחון הלאומי, LLC, מפעיל של לוס אלמוס המעבדה הלאומית תחת חוזה מס DE-AC52-06NA25396 עם משרד אנרגיה של ארה"ב. הטיפול בעכברים במחקר זה עולה בקנה אחד עם פרוטוקול UCSD חיים מאושרים. רקמות אדם התקבלו כחלק מפרוטוקול IRB המאושר UCSD. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מאוניברסיטת 118645 תכנית נשיא דמי מעבדת קליפורניה (PG) והמענק NS047101 מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ו( מתקן Neuroscience מיקרוסקופי משותף, אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו) שבץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 | |
| AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 | |
| Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 | |
| Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 | |
| Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 | |
| Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 | |
| Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 | |
| Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 | |
| Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | |
| Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 | |
| Mayer's Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 | |
| Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 | |
| Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 | |
| OCT compound | VWR International | 25608-930 | |
| Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 | |
| Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 | |
| sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S | |
| TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 | |
| VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |
References
- Slayter, H. S., Wold, J. K., Midtvedt, T. Intestinal mucin of germ-free rats. Biochemical and electron-microscopic characterization. Carbohydr. Res. 222, 1-9 (1991).
- Lamblin, G. The carbohydrate diversity of human respiratory mucins: a protection of the underlying mucosa. Am. Rev. Respir. Dis. 144, S19-S24 (1991).
- Corfield, A. P., Carroll, D., Myerscough, N., Probert, C. S. Mucins in the gastrointestinal tract in health and disease. Front. Biosci. 6, D1321-D1357 (2001).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota. Clin. Microbiol. Rev. 19, 315-337 (2006).
- Kim, Y. S., Ho, S. B. Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress. Curr. Gastroenterol. Rep. 12, 319-330 (2010).
- Nochi, T., Kiyono, H. Innate immunity in the mucosal immune system. Curr. Pharm. Des. 12, 4203-4213 (2006).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol. Rev. 24, 210-229 (2011).
- McGuckin, M. A., Linden, S. K., Sutton, P., Florin, T. H.
- Knowles, M. R., Boucher, R. C. Mucus clearance as a primary innate defense mechanism for mammalian airways. J. Clin. Invest. 109, 571-577 (2002).
- Johansson, M. E. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15064-15069 (2008).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat. Rev. Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Hayat, M. A. Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy. Hayat, M. A. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, NY. 53-70 (2002).
- Cohen, M., Hurtado-Ziola, N., Varki, A. ABO blood group glycans modulate sialic acid recognition on erythrocytes. Blood. 114, 3668-3676 (2009).
- Cohen, M., Varki, A. The sialome--far more than the sum of its parts. OMICS. 14, 455-464 (2010).
- Ota, H., Katsuyama, T. Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous later. Histochemical J. 24, 86-92 (1992).
- Matsuo, K., Ota, H., Akamatsu, T., Sugiyama, A., Katsuyama, T. Histochemistry of the surface mucous gel layer of the human colon. Gut. 40, 782-789 (1997).
- Boyde, A., Maconnachie, E. Treatment with lithium salts reduces ethanol dehydration shrinkage of glutaraldehyde fixed tissue. Histochemistry. 66, 181-187 (1980).
