Gefixeerde bevroren weefselmonsters ingebed in optimale snijtemperatuur medium (OCT) kan worden gebruikt om natuurlijke verspreiding en glycosylering van afgescheiden slijm bestuderen. In deze benadering weefselverwerking minimaal is en de natuurlijke presentatie van glycolipiden, en mucinen glycan-epitopen behouden blijft. Weefselcoupes kunnen worden geanalyseerd door immunohistochemie met behulp van fluorescentie of chromogene detectie.
Mucinen zijn complex en zwaar geglycosyleerd O-gekoppelde glycoproteïnen, die meer dan 70% koolhydraten bevatten gew 1-3. Uitgescheiden mucinen, geproduceerd door slijmbekercellen en het maagslijmvlies, bieden de steiger een micrometers dikke slijm laag die het epitheel van de darm en luchtwegen 3,4. Naast mucinen, slijm lagen bevatten antimicrobiële peptiden, cytokinen en immunoglobulinen 5-9. De slijmlaag is een belangrijk onderdeel van gastheer aangeboren immuniteit, en vormt de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen 8,10-12. Als zodanig, het slijm is onderhevig aan talrijke interacties met microben, zowel pathogenen en symbionten en uitgescheiden mucinen vormen een belangrijke schakel voor deze interacties. De studie van dergelijke biologische interacties gaat het meestal histologische methoden voor weefsel verzamelen en kleuring. De twee meest gebruikte methoden voor histologische weefselverzameltoestel en Preservationatie in de kliniek en in onderzoekslaboratoria zijn: formalinefixatie gevolgd door paraffine en weefsel bevriezing, gevolgd door inbedding in cryo-beschermingsmiddel media.
Paraffine-ingebed weefsel monsters te produceren secties met optimale eigenschappen voor histologische visualisatie inclusief helderheid en een goed gedefinieerde morfologie. Tijdens de paraffine inbedden een aantal epitopen worden gewijzigd en om deze epitopen te bestuderen, weefselcoupes moeten verder worden verwerkt met een van de vele methoden epitoop 13. Uitgescheiden mucinen en lipiden geëxtraheerd uit het weefsel tijdens de paraffine-inbedding clearing stap, die vereist verlengen incubatie met organische oplosmiddelen (xyleen of Citrisolv). Daarom is deze benadering niet optimaal voor studies gericht op de aard en verspreiding van mucinen en slijm in vivo.
In tegenstelling, bevriezing weefsels in optimale snijden Temperatuur (OCT) inbedding medium eenvides uitdroging en clearing van het monster, en onderhoudt het monster hydratatie. Dit maakt een betere bescherming van het gehydrateerde mucuslaag, en aldus maakt de studie van de vele rollen van mucinen in epitheliale biologie. Aangezien deze methode vereist minimale verwerking van het weefsel, wordt het weefsel verduurzaamd in een meer natuurlijke toestand. Daarom bevroren weefsels delen vereisen geen extra bewerkingen voor kleuring en kan gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van immunohistochemie methoden.
We tonen het behoud van micrometers dik uitgescheiden slijm laag in bevroren colon monsters. Deze laag is drastisch verminderd wanneer dezelfde weefsels ingebed in paraffine. We tonen ook aan immunofluorescentiekleuring van glycan epitopen op mucinen het gebruik van plantaardige lectines. Het voordeel van deze aanpak is dat het niet het gebruik van speciale fixatieven vereisen en maakt gebruik bevroren weefsels die al worden bewaard in het laboratorium.
Behoud van slijm en glycan epitopen in bevroren weefsels superieur is aan die van weefsels die zijn ingebed in paraffine. We toonden het behoud van uitgescheiden mucuslaag (figuren 1 en 3) en de verdeling van drie glycanen structuren (figuur 3) in bevroren weefsels vergeleken met paraffine ingebedde weefsels. Gespecialiseerde fixatieven, zoals Carnoy's oplossing (60% ethanol, 30% chloroform, 10% azijnzuur) 17 ontwikkeld voor optimaal behoud van de slijmlaag in weefselmonsters. Optimaal dienen deze oplossing worden gebruikt om weefselmonsters die speciaal voor mucus studies verzamelen en bleek een goede weergave van mucuslaag 16-17 behouden. De slijmlaag in gefixeerde bevroren monsters ingebed in OCT ruwe weergegeven en in sommige gebieden kunnen losmaken van het weefsel, maar de totale laagdikte in overeenstemming met die waargenomen in weefsels die werden met Carnoy's oplossing en embedded in paraffine 16-17. Bijvoorbeeld, de slijmlaag in bevroren menselijk colon weefselsectie is ~ 100 urn (figuur 1), die binnen het interval dat voor Carnoy's gefixeerde menselijke colon monster 55,4 ± 2,5 pm (bereik 7,7 tot 204,8 pm) 16.
Het is al decennia bekend dat ethanol dehydratie resulteert in ~ 30% krimp van biologische monsters 18, en organische oplosmiddelen zoals xyleen, Citrisolv en chloroform extract lipiden, glycolipiden en tot op zekere hoogte, eiwitten van de weefsels 13. Tissue verwerking voor paraffine inbedding omvat de volgende stappen: fixatie (10% gebufferde formaline), uitdroging (toenemende ethanol concentratie), en clearing (Citrisolv of xyleen). Door het nabootsen van deze stappen losgemaakt ingevroren weefselsecties, we aangetoond dat Citrisolv slijm uit ingevroren weefselsecties resulteert in weefsel morfologie die vergelijkbaar is met die van in paraffine ingebedde weefsels extracten (Figure 2, rechter paneel). Daarentegen werd de mucuslaag niet veranderd door incubatie met formaline of ethanol (figuur 2, links en middenpanelen). Dit suggereert dat de clearing stap van standaard paraffine inbedding procedure, die langdurige incubatie nodig heeft Citrisolv / xyleen, resulteert in de ineenstorting van de slijmlaag. Formalinefixatie niet beschadigt de slijmlaag en bevroren weefsel secties werden gefixeerd met formaline kan gemakkelijk worden gekleurd met lectinen en antilichamen tegen glycanen, glycolipiden en eiwitten (figuren 2, 3 en 6). Deze effecten kunnen verwaarloosbaar voor de studie van membraangebonden eiwitten en weefsel pathologie, maar zijn verwoestend voor sterk gehydrateerde structuren zoals de afgescheiden mucuslaag. Echter histologische studies van mucinen worden nog steeds hoofdzakelijk uitgevoerd met paraffine ingebedde monsters, waarbij de mucuslaag behoud niet optimaal. Diepgaande analyses van mucuslaag samenstelling zoals de precieze identiteit van secreted of membraangebonden glycoproteïne MUC combinaties vereisen specifieke antilichamen en massaspectrometrie voor identificatie van het eiwit backbones. Behoud van de mucuslaag slechts de eerste vereiste voor dergelijke studies.
Veel laboratoria hebben weefselmonsters bevroren in OCT die werden in het verleden verzameld voor verschillende projecten, kunnen deze weefsels gemakkelijk worden gebruikt om mucinen, glycolipiden en glycan distributie waardoor de noodzaak om weefsels te verzamelen in speciale fixatieven die uniek zijn ontworpen voor slijm behoud bestuderen. Bevroren weefsels minimale verwerking ondergaan en daarom de natuurlijke verdeling van glycanen, die gehydrateerd aard, behouden blijft. Dit is bijzonder belangrijk op het gebied van microbiële gastheer interacties. Kennis van naturalistische verspreiding en de grootte van uitgescheiden mucinen en de vele glycaanstructuren decoreren van deze "barrière" moleculen zal de sleutel in het begrijpen van de afweer, microbiële uitbuiting en pathogenenis.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Nicole M. Nemeth (University of Georgia) en Jeanne M. Fair (LANL) bedanken voor hun hulp bij het oogsten van kip weefsels, en Steven A. Springer voor zijn hulp tijdens het filmen. De zorg van alle vogels in deze studie in overeenstemming was met National Institutes of Health richtlijnen voor het humane gebruik van proefdieren en alle protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies bij Los Alamos National Security, LLC, operator van de Los Alamos National Laboratory in Contract No DE-AC52-06NA25396 met het Amerikaanse ministerie van Energie. De zorg van de muizen in dit onderzoek is in overeenstemming met UCSD dier goedgekeurde protocol. Menselijke weefsels werden verkregen als onderdeel van UCSD goedgekeurde IRB protocol. Dit werk werd ondersteund door subsidies 118645 van Universiteit van Californië Lab Fee Voorzitter Program (PG) en het verlenen van NS047101 van Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (Neuroscience Microscopie Shared Facility, UC San Diego).
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |