Unfixierter gefrorenen Gewebeproben in Optimal Cutting Temperatur Medium (OCT) eingebettet werden verwendet, um natürliche Verteilung und Glykosylierung von sezernierten Schleim zu studieren. Bei diesem Ansatz Gewebe-Verarbeitung ist minimal und die natürliche Darstellung der Glycolipide, Schleimstoffe und Glykan-Epitope erhalten. Gewebeschnitte können immunhistochemisch mittels Fluoreszenz oder chromogener Detektion analysiert werden.
Mucine sind komplex und stark glykosyliert O-verknüpften Glykoproteine, die mehr als 70% Kohlenhydrate enthalten Gew. 1-3. Sezernierten Muzine, produziert von Becherzellen und der Magenschleimhaut, bieten das Gerüst für eine Mikrometer dicke Schleimschicht, die Linien der Epithelien des Darms und der Atemwege 3,4. Neben Mucinen, Schleim Schichten enthalten auch antimikrobielle Peptide, Cytokine und Immunglobuline 5-9. Die Schleimschicht ist ein wichtiger Teil der Host angeborenen Immunität und bildet die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen 8,10-12. Als solche, die Schleim unterliegen zahlreichen Interaktionen mit Mikroben ist, bilden beide Pathogene und Symbionten, und sezernierten Muzine eine wichtige Schnittstelle für diese Wechselwirkungen. Die Untersuchung solcher biologischen Wechselwirkungen Regel beinhaltet histologischen Methoden zur Gewebesammelbeutel und Färbung. Die beiden am häufigsten verwendeten histologischen Methoden für die Gewebe-Sammlung und preservation in der Klinik und in Forschungslabors sind: Formalinfixierung durch Paraffineinbettung folgte, und Gewebe Gefrieren, gefolgt von der Einbettung in Cryo-Schutzmittel Medien.
Paraffin eingebetteten Gewebeproben erzeugen Schnitte mit optimalen Eigenschaften für die histologische Visualisierung mit Klarheit und gut definierten Morphologie. Jedoch während des Einbettungsprozesses Paraffin mehrere Epitope verändert werden, und um diese Epitope zu studieren, Gewebeschnitte weiter mit einer von vielen Methoden Epitopdemaskierung 13 verarbeitet werden müssen. Sekretiert Mucinen und Lipiden aus dem Gewebe während der Einbettung in Paraffin Lichtung Schritt, der zu verlängern Inkubation mit organischen Lösungsmitteln (Xylol oder Citrisolv) erfordert extrahiert. Daher ist dieser Ansatz nicht optimal für Studien, die die Art und Verteilung der Mucinen und Schleim in vivo.
Im Gegensatz dazu die Einbettung Gefrierpunkt Gewebe Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium einHohlräume Austrocknung und Aufhellung der Probe und unterhält die Probe Feuchtigkeit. Dies ermöglicht eine bessere Konservierung des hydratisierten Schleimschicht, und ermöglicht somit die Untersuchung der zahlreichen Rollen der Mucine in epithelialen Biologie. Da diese Methode erfordert minimale Verarbeitung des Gewebes wird das Gewebe in einem natürlichen Zustand belassen. Deshalb eingefroren Geweben Abschnitte erfordern keine zusätzliche Verarbeitung vor der Färbung und können leicht analysiert werden mittels Immunhistochemie Methoden.
Wir zeigen die Erhaltung Mikrometer dicken ausgeschieden Schleimschicht in gefrorenem Doppelpunkt Proben. Diese Schicht wird drastisch reduziert, wenn die gleichen Gewebe in Paraffin eingebettet sind. Wir zeigen auch Immunfluoreszenzfärbung von Glykan Epitope auf Schleimstoffe mit Pflanzenlektinen vorgestellt. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es erfordert nicht die Verwendung von speziellen Fixiermittel und ermöglicht die Verwendung gefrorenen Gewebe, die bereits im Labor aufbewahrt werden kann.
Konservierung von Schleim und Glycan Epitope in gefrorenen Geweben ist besser als die der Gewebe, die in Paraffin eingebettet waren. Wir haben gezeigt, die Erhaltung von sekretiertem Schleimschicht (1 und 3) und der Verteilung von drei Glycane Strukturen (Abbildung 3) in gefrorenen Geweben verglichen mit Paraffin eingebetteten Geweben. Spezialisierte Fixiermittel, wie Carnoys Lösung (60% Ethanol, 30% Chloroform, 10% Essigsäure) 17 sind für eine optimale Konservierung der Schleimschicht in Gewebeproben entwickelt. Optimalerweise sollte diese Lösung verwendet, um Gewebeproben für Schleim Studien gewidmet sind einzuziehen und wurde gezeigt, dass die glatte Aussehen Schleimschicht 16-17 erhalten. Die Schleimschicht in unfixierten eingefrorenen Proben in den Oktober eingebettetes robust und in einigen Bereichen kann aus dem Gewebe lösen, aber die gesamte Schichtdicke ist in Übereinstimmung mit dem im Gewebe, die mit Carnoy-Lösung und einbetten behoben wurden beobachteted in Paraffin 16-17. Zum Beispiel ist die Schleimschicht in gefrorener Gewebeschnitt menschlichen Dickdarm ~ 100 um (Abbildung 1), die innerhalb des Bereichs für Carnoy's-fixierten humanen Kolons Probe 55,4 ± 2,5 um (Bereich 7,7 bis 204,8 um) beträgt 16 gemeldet.
Es ist seit Jahrzehnten bekannt, dass Ethanol Dehydratisierung Ergebnisse in ~ 30% Schrumpf von biologischen Proben 18 und dass organische Lösungsmittel, wie Xylol, Proteine Citrisolv und Chloroformextrakt Lipide, Glykolipide und, in gewissem Maße von den Geweben 13. Tissue-Verarbeitung für Paraffineinbettung umfasst die folgenden Schritte: Fixierung (10% gepuffertem Formalin), Dehydration (steigende Ethanol-Konzentration) und Clearing (Citrisolv oder Xylol). Durch Nachahmung diese Schritte auf unfixierten gefrorenen Gewebeschnitten, zeigten wir, dass Citrisolv Schleim von Gefrierschnitten wodurch Gewebemorphologie die ähnlich derjenigen von in Paraffin eingebetteten Geweben ist extrahiert (Figure 2, rechts). Im Gegensatz dazu wurde die Schleimschicht nicht durch Inkubation mit Formalin oder Ethanol (Abb. 2, links und Mitte-Panels) verändert. Dies deutet darauf hin, dass das Clearing Schritt von Standard Paraffineinbettung Verfahren, das verlängerte Inkubationszeit erfordert in Citrisolv / Xylol, führt zum Kollabieren der Schleimschicht. Formalinfixierung nicht beschädigt Schleimschicht und gefrorenen Gewebe Abschnitte, die mit Formalin fixiert wurden, können leicht mit Lektine und Antikörper gegen Glykane, Glykolipide und Proteine (Abbildungen 2, 3 und 6) gefärbt werden. Diese Effekte vernachlässigbar sein für das Studium der membrangebundenen Proteine und Gewebepathologie, aber sie sind für hochhydratisierten Strukturen wie der sezernierte Schleimschicht verheerend. Jedoch histologische Untersuchungen von Mucinen noch meist mit Paraffin eingebettete Proben, bei der die Schleimschicht Konservierung nicht optimal durchgeführt. In eingehenden Analysen der Schleimschicht Zusammensetzung wie die genaue Identität secreted oder membrangebundene MUC Glykoprotein Kombinationen erfordern spezifische Antikörper und Massenspektrometrie zur Identifizierung der Protein-Backbones. Erhaltung der Schleimschicht ist aber die anfängliche Anforderung für solche Studien.
Vielen Laboratorien haben Gewebeproben in OCT eingefroren, die in der Vergangenheit für verschiedene Projekte wurden gesammelt, können diese Gewebe ohne weiteres eingesetzt werden zu Mucinen, Glykolipide und Glycan Verteilung entfällt die Notwendigkeit, Geweben in spezielle Fixiermittel, der einzigartig für Schleim Konservierung entworfen sammeln studieren. Gefrorenem Gewebe unterziehen minimale Verarbeitung und somit die natürliche Verbreitung der Glykane, die hydratisiert in der Natur sind, wird beibehalten. Dies ist besonders wichtig in dem Bereich der mikrobielle Wirt-Wechselwirkungen. Kenntnisse der naturalistischen Verteilung und Häufigkeit von sezernierten Muzine und die vielen Glykanstrukturen schmücken diese "Barriere" Moleküle werden der Schlüssel für das Verständnis Immunabwehr, mikrobielle Ausbeutung und Erregerist.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei Nicole M. Nemeth (University of Georgia) und Jeanne M. Fair (LANL) für ihre Hilfe bei der Ernte Hühnerfleisch danken und Steven A. Springer für seine Hilfe während der Dreharbeiten. Die Betreuung aller Vögel in dieser Studie war in Übereinstimmung mit National Institutes of Health Leitlinien für die humane Nutzung von Labortieren und alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Formate Ausschüsse am Los Alamos National Security, LLC, Betreiber des Los Alamos zugelassen National Laboratory unter Vertrag Nr. DE-AC52-06NA25396 mit dem US Department of Energy. Die Pflege der Mäuse in dieser Studie ist in Übereinstimmung mit UCSD Tier zugelassenen Protokolls. Menschliche Gewebe wurden als Teil der UCSD zugelassenen IRB-Protokoll erhalten. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse 118.645 von der University of California Lab Fee President Program (PG) und Grant NS047101 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Neuroscience Microscopy Gemeinsame Facility, UC San Diego) unterstützt.
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |