ويمكن استخدام عينات الأنسجة المجمدة غير المثبتة جزءا لا يتجزأ من قطع متوسطة درجة الحرارة المثلى (OCT) لدراسة توزيع الطبيعية وارتباط بالغليكوزيل من المخاط يفرز. في هذا النهج معالجة الأنسجة هو الحد الأدنى ويتم الاحتفاظ العرض الطبيعي للmucins، السكرية وغليكان الحواتم. ويمكن تحليل المقاطع النسيجية المناعية باستخدام الكشف من قبل مضان أو مولد اللون.
Mucins معقدة والغليكوزيلاتي بشكل كبير O-المرتبطة البروتينات السكرية التي تحتوي على الكربوهيدرات أكثر من 70٪ وزنا 1-3. mucins يفرز، التي تنتجها الخلايا الكأسية والغشاء المخاطي في المعدة، وتوفير سقالة لطبقة المخاط ميكرومتر سميكة التي خطوط ظهائر للامعاء والجهاز التنفسي 3،4. بالإضافة إلى mucins، طبقات تحتوي أيضا على مخاط الببتيدات المضادة للميكروبات، السيتوكينات، والمناعية 5-9. طبقة المخاط هو جزء مهم من الحصانة الفطرية المضيفة، ويشكل خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الدقيقة 8،10-12. على هذا النحو، فإن المخاط يخضع لتفاعلات عديدة مع الميكروبات، سواء مسببات الأمراض والمتكافلة، ويفرز mucins تشكل واجهة مهمة لهذه التفاعلات. دراسة التفاعلات البيولوجية مثل هذه الأساليب عادة ما ينطوي النسيجي لجمع الأنسجة وتلطيخ. وطريقتين النسيجي الأكثر استخداما لجمع الأنسجة وpreservأوجه في العيادة ومختبرات البحوث في ما يلي: تثبيت الفورمالين تليها تضمين البارافين، وتجميد الأنسجة، تليها التضمين في البرد حاصن سائل الإعلام.
عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين إنتاج المقاطع مع الصفات المثلى لرؤية النسيجية بما في ذلك الوضوح والتشكل واضحة المعالم. ومع ذلك، أثناء عملية دمج البارافين عدد من الحواتم تصبح غيرت ومن أجل دراسة هذه الحواتم، أقسام الأنسجة يجب أن تتم معالجتها كذلك مع واحدة من العديد من الطرق استرجاع حاتمة 13. يتم استخراج mucins يفرز الدهون والأنسجة من خلال خطوة المقاصة البارافين، تضمين، الأمر الذي يتطلب إطالة الحضانة مع المذيبات العضوية (الزيلين أو Citrisolv). لذلك هذا النهج هو دون المستوى الأمثل للدراسات تركز على طبيعة وتوزيع mucins والمخاط في الجسم الحي.
في المقابل، الأنسجة التجمد في درجة الحرارة المثلى للقطع (OCT) لتضمين المتوسطةالفراغات الجفاف والمقاصة من العينة، ويحافظ على ترطيب العينة. وهذا يسمح لتحسين الحفاظ على طبقة المخاط رطب، وبالتالي يسمح دراسة العديد من الأدوار في علم الأحياء mucins الظهارية. لأن هذا الأسلوب يتطلب معالجة الحد الأدنى من الأنسجة، ويتم الاحتفاظ الأنسجة في حالة أكثر طبيعية. تجميد الأنسجة لذلك أقسام لا تتطلب أي معالجة إضافية قبل تلطيخ ويمكن تحليلها بسهولة باستخدام أساليب المناعية.
علينا أن نبرهن للحفاظ على طبقة سميكة ميكرومتر مخاط يفرز في عينات القولون المجمدة. هو انخفاض شديد عند هذه الطبقة هي جزء لا يتجزأ من الأنسجة نفسها في البارافين. علينا أن نبرهن أيضا تلطيخ المناعي من الحواتم غليكان عرض على mucins باستخدام يكتينس النبات. وميزة هذا النهج هو أنه لا يتطلب استخدام مثبتات خاصة ويسمح باستخدام الأنسجة المجمدة التي قد يتم الاحتفاظ بالفعل في المختبر.
الحفاظ على المخاط والحواتم غليكان في الأنسجة المجمدة أعلى من الأنسجة التي تم تضمينها في البارافين. أثبتنا الحفاظ على طبقة مخاط (الشكلان 1 و 3) وتوزيع الهياكل glycans الثلاثة (الشكل 3) في الأنسجة المجمدة مقارنة مع الأنسجة البارافين، جزءا لا يتجزأ من. مثبتات المتخصصة، مثل حل Carnoy ل(الإيثانول 60٪، 30٪ كلوروفورم، وحامض الخليك 10٪) وضعت 17 لحفظ الأمثل للطبقة المخاط في عينات الأنسجة. على النحو الأمثل، يجب استخدام هذا الحل لجمع عينات من الأنسجة التي هي مخصصة للدراسات المخاط، وتبين للحفاظ على المظهر الناعم للطبقة المخاط 16-17. طبقة المخاط في العينات المجمدة جزءا لا يتجزأ من غير المثبت في أكتوبر الوعرة ويظهر في بعض المناطق قد فصل من الأنسجة، ولكن سمك الطبقة العامة ما يتفق مع تلك التي لوحظت في الأنسجة التي تم إصلاحها مع حل Carnoy وembeddإد في البارافين 16-17. على سبيل المثال، طبقة المخاط في المجمدة الإنسان القولون هو الجزء الأنسجة ~ 100 ميكرون (الشكل 1)، والذي هو ضمن نطاق الإبلاغ عن Carnoy's الثابتة عينة القولون الإنسان 55،4 ± 2.5 ميكرومتر (المدى 7،7 حتي 204،8 ميكرومتر) 16.
وقد كان من المعروف منذ عشرات السنين أن نتائج الجفاف في الإيثانول ~ انكماش 30٪ من العينات البيولوجية 18، والتي المذيبات العضوية مثل الزيلين، والدهون Citrisolv استخراج كلوروفورم، والسكرية، إلى حد ما، والبروتينات من الأنسجة 13. معالجة الأنسجة لتضمين البارافين يتضمن الخطوات التالية: تثبيت (10٪ مخزنة الفورمالين)، والجفاف (زيادة تركيز الإيثانول)، والمقاصة (Citrisolv أو الزيلين). عن طريق محاكاة هذه الخطوات على غير المثبتة أقسام الأنسجة المجمدة، أثبتنا أن Citrisolv مقتطفات من المخاط أقسام الأنسجة المجمدة مما أدى إلى مورفولوجيا الأنسجة التي هي مماثلة لتلك الأنسجة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (الارقام ..ه 2، اللوحة اليمنى). في المقابل، لم يتم تغييرها طبقة المخاط من الحضانة مع الفورمالين أو الإيثانول (الشكل 2، يسار ووسط لوحات). هذا يشير إلى أن الخطوة المقاصة على مستوى الإجراء تضمين البارافين، الأمر الذي يتطلب فترة طويلة في الحضانة Citrisolv / الزيلين، والنتائج في انهيار طبقة المخاط. تثبيت الفورمالين لا تضر بطبقة المخاط والمجمدة أقسام الأنسجة التي تم إصلاحها مع الفورمالين يمكن بسهولة أن ملطخة يكتينس والأجسام المضادة ضد السكرية، glycans والبروتينات (أرقام 2 و 3 و 6). قد تكون هذه الآثار تافهة لدراسة غشاء محدد البروتينات والأنسجة علم الأمراض، لكنها مدمرة للهياكل رطب للغاية مثل طبقة المخاط يفرز. وتجرى الدراسات النسيجية لا تزال مع ذلك من mucins في الغالب مع عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين، والتي طبقة المخاط المحافظة هو دون المستوى الأمثل. في عمق التحليلات تكوين طبقة المخاط مثل هوية الدقيق لذاتهcreted أو غشاء محدد بروتين سكري تركيبات الأجسام المضادة تتطلب MUC محددة وقياس الطيف الكتلي لتحديد العمود الفقرى البروتين. الحفاظ على طبقة المخاط ولكن شرط أولي لمثل هذه الدراسات.
مختبرات العديد من عينات الأنسجة المجمدة في أكتوبر التي تم جمعها في الماضي لمشاريع مختلفة، ويمكن استخدامها بسهولة هذه الأنسجة لدراسة mucins، السكرية وتوزيع غليكان مما يلغي الحاجة لجمع الأنسجة في مثبتات خاصة التي تم تصميمها بشكل فريد لحفظ المخاط. الأنسجة المجمدة تخضع لمعالجة الحد الأدنى، وبالتالي فإن التوزيع الطبيعي من glycans، والتي هي في الطبيعة المائية، والحفاظ عليها و. هذا مهم بشكل خاص في مجال الجراثيم في استضافة التفاعلات. ومعرفة توزيع طبيعي وفرة من mucins يفرز والهياكل غليكان العديد من تزيين هذه "الحاجز" الجزيئات تكون المفتاح لفهم دفاع المضيف، والاستغلال الميكروبية وpathogenesهو.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر نيكول M. نيميث (جامعة جورجيا) وجين M. معرض (LANL) لمساعدتهم في حصاد الأنسجة الدجاج، وستيفن A. سبرينغر لمساعدته أثناء التصوير. كان رعاية جميع الطيور في هذه الدراسة وفقا للمعاهد القومية للصحة المبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات المختبرية الإنسانية للجميع والبروتوكولات وافق عليها رعاية الحيوان المؤسسية واللجان الوطنية في استخدام لوس ألاموس الأمن، LLC، مشغل لوس ألاموس المختبر الوطني بموجب العقد رقم DE-AC52-06NA25396 مع وزارة الطاقة في الولايات المتحدة. رعاية الفئران في هذه الدراسة هو في الامتثال لبروتوكول جامعة كاليفورنيا سان دييغو الحيوان المعتمدة. تم الحصول على الأنسجة البشرية كجزء من بروتوكول جامعة كاليفورنيا سان دييغو IRB المعتمدة. وأيد هذا العمل من قبل منحة من جامعة 118645 رسوم كاليفورنيا مختبر رئيس برنامج (PG) وNS047101 منحة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (علم الأعصاب الميكروسكوب مرفق مشترك، جامعة كاليفورنيا في سان دييغو).
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |