דגימות רקמה קפוא מבולבלות גלומות במדיום טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר) יכולות לשמש כדי לחקור הפצה וglycosylation טבעית של ריר מופרש. בעיבוד רקמות גישה זו היא מינימאלי והמצגת הטבעית של גליקוליפידים, mucins וglycan-אפיטופים נשמרה. סעיפי רקמות יכולים להיות מנותחים על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות זיהוי פלואורסצנטי או chromogenic.
Mucins הם גליקופרוטאינים O צמודים מורכבים וכבדות מסוכרת, המכילים פחמימות יותר מ 70% ממשקל 1-3. mucins המופרש, המיוצר על ידי תאי גביע ורירית הקיבה, מספק פיגום לשכבת ריר מיקרומטרים בעובי שקווי epithelia של המעיים ומערכת נשימת 3,4. בנוסף לmucins, שכבות ריר מכילות גם פפטידים מיקרוביאלית, הציטוקינים ונוגדנים 5-9. שכבת הריר היא חלק חשוב מחסינות מולדת מארח, ומהווה את קו ההגנה הראשון נגד פולשי מיקרואורגניזמים 8,10-12. ככזה, הליחה כפופה לאינטראקציות רבות עם חיידקים, שני פתוגנים וsymbionts וmucins המופרש יוצרים ממשק חשוב לאינטראקציות אלה. המחקר של אינטראקציות ביולוגיות כאלה בדרך כלל שיטות היסטולוגית לאיסוף רקמות וכתמים. שתי השיטות הנפוצות ביותר היסטולוגית לאיסוף רקמות וpreservation במרפאת ובמעבדות מחקר הוא: קיבוע פורמלין ואחרי הטבעת פרפין, והקפאת רקמות, ואחרי ההטבעה בתקשורת cryo-protectant.
דגימות רקמת פרפין המוטבע בייצור חלקים עם תכונות אופטימליות להדמיה היסטולוגית כולל בהירות ומורפולוגיה מוגדרת היטב. עם זאת, במהלך תהליך הטבעת פרפין מספר אפיטופים הפך שונה וכדי ללמוד אפיטופים אלה, חלקי רקמה צריכים להיות מעובד נוסף עם אחד משיטות יחזרו epitope רבות 13. mucins ושומנים מופרשים מופקים מהרקמות במהלך צעד סליקת פרפין ההטבעה, הדורש להאריך דגירה עם ממסים אורגניים (קסילן או Citrisolv). לכן גישה זו היא תת אופטימלית למחקרים שהתמקדו בטבע וההפצה של mucins וליחה בגוף חי.
לעומת זאת, רקמות הקפאה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) הטבעה בינוניתחללי התייבשות וסליקה של המדגם, ושומר על לחות המדגם. זה מאפשר לשימור טוב יותר של שכבת ריר ההתייבשות, ובכך מאפשר הלימוד של התפקידים הרבים של mucins בביולוגית אפיתל. מאחר שהשיטה זאת דורשת עיבוד מינימאלי של הרקמה, הרקמה נשמרה במצבו טבעי יותר. סעיפי רקמות קפואות לכן אינם דורשים כל טיפול נוסף, לפני הצביעה ויכולים בקלות להיות מנותח באמצעות שיטות אימונוהיסטוכימיה.
אנחנו מדגימים שימור שכבת ריר מיקרומטרים בעובי מופרש במעי גס בדגימות מוקפאות. שכבה זו היא באופן דרסטי כאשר אותם רקמות מוטבעות בפרפין. אנחנו גם מדגימים מכתימים immunofluorescence של אפיטופים glycan הוצגו על mucins באמצעות קטיני צמח. היתרון של גישה זו הוא שהיא אינה דורשת את השימוש בfixatives המיוחד ומאפשרת ניצול רקמות קפואות שעשויות להיות כבר נשתמרו במעבדה.
שימור אפיטופים ריר וglycan ברקמות קפואות עדיף על זה של רקמות שהוטבעו בפרפין. אנחנו הוכחנו שימור שכבת ריר מופרש (תרשימי 1 ו 3) וההפצה של שלושה מבני glycans (איור 3) ברקמות קפואות לעומת רקמות פרפין מוטבעים. fixatives מיוחד, כגון הפתרון של Carnoy (אתנול 60%, כלורופורם 30%, 10% חומצה אצטית) 17 פותחו לשימור אופטימלי של שכבת הריר בדגימות רקמה. במצב אופטימלי, פתרון זה עשוי לשמש לאיסוף דגימות רקמה שמוקדשות ללימודי ריר והוצג לשמור על המראה התקין של שכבת ריר 16-17. שכבת הריר בדגימות קפואות מבולבלות המוטבעת באוקטובר מופיעה מחוספסת ובאזורים מסוימים עשויה להתנתק מהרקמות, לעומת זאת עובי השכבה הכולל הוא בהסכם עם זה שנצפה ברקמות שהיו קבועים עם הפתרון וembedd של Carnoyאד בפרפין 16-17. לדוגמה, שכבת הריר בסעיף רקמה קפוא מעי גס היא ~ 100 מיקרומטר (איור 1), שנמצא בטווח שדווח למדגם Carnoy's קבוע מעי גס 55.4 ± 2.5 מיקרומטר (טווח 7.7-204.8 מיקרומטר) 16.
זה כבר ידוע במשך עשרות שנים שתוצאות התייבשות אתנול בהצטמקות ~ 30% מדגימות ביולוגיות 18, וכי ממסים אורגניים כגון קסילן, שומנים כלורופורם לחלץ, גליקוליפידים, ובמידה מסוימת, Citrisolv וחלבונים מהרקמות 13. עיבוד רקמות להטבעת פרפין כולל את השלבים הבאים: קיבעון (10% נאגרו פורמלין), התייבשות (ריכוז אתנול הגדלה), וסליקה (Citrisolv או קסילן). על ידי חיקוי הפעולות הבאות על חלקי רקמה קפוא יתבטלו, הראינו כי תמציות Citrisolv ליחה מחלקי רקמה קפוא וכתוצאה ממורפולוגיה רקמה שדומה לזו של רקמות פרפין מוטבע (Figurדואר 2, לוח ימני). בניגוד לכך, שכבת הריר לא שונתה על ידי דגירה עם פורמלין או אתנול (איור 2, שמאל ומרכז פנלים). הדבר מצביע על כך צעד הסליקה של הליך הטבעת פרפין הסטנדרטי, אשר דורש דגירה ממושכת בCitrisolv / קסילן, התוצאות בקריסה של שכבת הריר. קיבעון פורמלין אינו פוגע בחלקי רקמות קפואים ושכבת הריר שהיו קבועים בפורמלין יכול בקלות להיות מוכתם בקטינים ונוגדנים נגד glycans, גליקוליפידים וחלבונים (איורים 2, 3, 6). השפעות אלה עשויות להיות זניחות לחקר חלבוני קרום כפותים ורקמות פתולוגיה, אבל הם הרסניים למבני hydrated מאוד כגון שכבת הריר המופרש. עם זאת מחקרים היסטולוגיים של mucins עדיין מתנהלים בעיקר עם דגימות פרפין מוטבע-, שבו שימור שכבת הריר היא הכי מוצלח. בניתוח מעמיק של הרכב שכבת ריר כגון זהותו המדויקת של seשילובי גליקופרוטאין MUC כפותים creted או קרום דורשים נוגדנים ספציפיים וספקטרומטריית מסות לזיהוי מעמודי תווך החלבון. שימור שכבת הריר הוא אך הדרישה הראשונית ללימודים כאלה.
מעבדות רבות דגימות רקמה קפואה באוקטובר שנגבו בעבר עבור פרויקטים שונים, רקמות אלה יכולות לשמש בקלות ללמוד mucins, גליקוליפידים, והפצת glycan מבטלת את הצורך לאסוף רקמות לתוך fixatives המיוחד המיועדים באופן ייחודי לשימור ריר. רקמות קפואות עוברות עיבוד מינימאלי ולכן החלוקה הטבעית של glycans, שהם hydrated בטבע, נשמרה. זה חשוב במיוחד בתחום של אינטראקציות מיקרוביאלי-מארחת. ידע של הפצה ושפע נטורליסטית של mucins מופרש והרבה מבני glycan לקשט מולקולות אלה "מכשול" יהיה מפתח להבנת הגנה מארחת, ניצול חיידקים וpathogenesהוא.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לניקול מ 'נמט (אוניברסיטת ג'ורג'יה) וז'אן פיר מ' (LANL) על עזר בקצירת רקמות עוף, וסטיבן א פרינגר על עזרתו בזמן צילומים. הטיפול של כל ציפור במחקר זה היה בעמידה במכונים הלאומיים לבריאות הנחיות לשימוש האנושי בחיות מעבדה ואת כל הפרוטוקולים אושרו על ידי טיפול בבעלי החיים וועדות המוסדיים השתמש בלוס אלמוס לביטחון הלאומי, LLC, מפעיל של לוס אלמוס המעבדה הלאומית תחת חוזה מס DE-AC52-06NA25396 עם משרד אנרגיה של ארה"ב. הטיפול בעכברים במחקר זה עולה בקנה אחד עם פרוטוקול UCSD חיים מאושרים. רקמות אדם התקבלו כחלק מפרוטוקול IRB המאושר UCSD. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מאוניברסיטת 118645 תכנית נשיא דמי מעבדת קליפורניה (PG) והמענק NS047101 מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ו( מתקן Neuroscience מיקרוסקופי משותף, אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו) שבץ.
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |