Bevegelig frosne vevsprøver innebygd i Optimal Cutting Temperatur medium (OCT) kan brukes til å studere naturlig fordeling og glykosylering av utskilt slim. I denne tilnærmingen vev behandlingen er minimal og den naturlige presentasjon av glykolipider mucins og glycan-epitoper er bevart. Vevsdelene kan analyseres ved immunhistokjemi med fluorescens eller kromogen deteksjon.
Mucins er komplekse og tungt glykosylert O-koblede glykoproteiner, som inneholder mer enn 70% karbohydrat etter vekt 1-3. Utskilt mucins, produsert av goblet celler og mage mucosa, gi stillas for en mikrometer tykt slim lag som linjer epitel i tarmen og luftveier 3,4. I tillegg til mucins, slim lag også inneholde antimikrobielle peptider, cytokiner, og immunglobuliner 5-9. Slim laget er en viktig del av verten medfødte immunitet, og danner den første linjen i forsvaret mot invaderende mikroorganismer 8,10-12. Som sådan, er slimet gjenstand for en rekke interaksjoner med mikrober, både patogener og symbionter, og skilles mucins danner et viktig grensesnitt for disse sammenhengene. Studiet av slike biologiske interaksjoner innebærer vanligvis histologiske metoder for vev innsamling og farging. De to mest brukte histologiske metoder for vev innsamling og Preservasjon i klinikken og i forskningslaboratorier er: formalin fiksering etterfulgt av parafin embedding, og vev fryser, etterfulgt av å sette inn i Cryo-protectant medier.
Parafin-innebygde vevsprøver produsere deler med optimale kvaliteter for histologisk visualisering inkludert klarhet og veldefinert morfologi. Men under parafin innebygging prosessen en rekke epitoper blir endret og for å studere disse epitoper, vevssnitt må viderebehandles med en av mange epitop uttaksmetodene 13. Utskilte mucins og lipider er hentet fra vevet under parafin-embedding clearing steg, som krever forlenge inkubasjon med organiske løsemidler (xylen eller Citrisolv). Derfor denne tilnærmingen er sub-optimal for studier med fokus på natur og distribusjon av mucins og slim in vivo.
I kontrast, frysing vev i Optimal Cutting Temperatur (OCT) innebygging medium enhulrom dehydrering og clearing av prøven, og opprettholder prøven hydrering. Dette gir bedre bevaring av hydratisert slimlaget, og dermed tillater studiet av de tallrike roller mucins i epithelial biologi. Som denne metoden krever minimal behandling av vev, er vevet bevart i en mer naturlig tilstand. Derfor frosset vev seksjoner ikke krever noen ytterligere behandling før farging og kan lett analyseres ved hjelp av immunhistokjemi metoder.
Vi viser bevaring av mikrometer tykt utskilt slimlaget i frosne kolon prøver. Dette laget er drastisk redusert når de samme vev er innebygd i parafin. Vi viser også immunfluorescens farging av sukkerkjedene epitoper presentert på mucins bruker anlegget lektiner. Fordelen med denne tilnærmingen er at den ikke krever bruk av spesielle fiksativer og tillater utnytte frosne vev som kan allerede bli bevart i laboratoriet.
Bevaring av slim og glycan epitoper i frosne vev er bedre enn av vev som ble bygd i parafin. Vi demonstrerte bevaring av utskilt slimlaget (figur 1 og 3) og fordeling av tre glykaner strukturer (figur 3) i frosne vev sammenlignet med parafin-embedded vev. Spesialiserte fiksativer som Carnoy løsning (60% etanol, 30% kloroform, 10% eddiksyre) 17 har blitt utviklet for optimal bevaring av slimlaget i vevsprøver. Optimalt bør denne løsningen brukes til å samle vevsprøver som er dedikert for slim studier og ble vist for å bevare den glatte utseende slimlaget 16-17. Slim lag i Bevegelig frosne prøver innebygd i OCT vises robust og i noen områder kan løsne fra vevet, men den samlede tykkelsen er i overensstemmelse med det som er observert i vev som ble løst med Carnoy løsning og embedded i parafin 16-17. For eksempel, er slimlaget i fryst menneskets tykktarm vevsdeler ~ 100 mikrometer (Figur 1), som er innenfor området rapportert for Carnoy's-fixed menneskets tykktarm prøven 55,4 ± 2,5 um (område 7,7 til 204,8 uM) 16.
Det har vært kjent i flere tiår at etanol dehydrering resulterer i ~ 30% krymping av biologiske prøver 18, og at organiske løsemidler som xylen, Citrisolv og Kloroformekstraktet lipider, glykolipider og til en viss grad, proteiner fra vevene 13. Tissue behandling for parafin innebygging omfatter følgende trinn: fiksering (10% bufret formalin), dehydrering (økende etanolkonsentrasjon) og avregning (Citrisolv eller xylen). Ved å etterligne disse trinnene på Bevegelige helligdager frosne vevsdelene, viste vi at Citrisolv trekker slim fra frosne vevsdelene resulterer i vev morfologi som er lik som parafin-embedded vev (Figur2 e, høyre panel). I kontrast, ble slimlaget ikke endres ved inkubasjon med formalin eller etanol (figur 2, venstre og midtfelter). Dette tyder på at clearing trinn av standard parafin embedding prosedyre, som krever forlenget inkubasjon i Citrisolv / xylen, resulterer i kollaps av slimlaget. Formalin fiksering ikke skader slimlaget og frosne vev seksjoner som ble løst med formalin kan lett farges med lektiner og antistoff mot glykaner, glykolipider og proteiner (figurene 2, 3 og 6). Disse effektene kan være ubetydelig for studiet av membran-bundet protein og vev patologi, men de er ødeleggende for svært hydrerte strukturer som det utskilte slimlaget. Men histologiske undersøkelser av mucins er fortsatt utført det meste med parafin-embedded prøver, der slimlaget bevaring er suboptimal. Dybdeanalyser av slimlaget sammensetning slik som den nøyaktige identiteten SEcreted eller membran bundet MUC glykoprotein kombinasjoner krever spesifikke antistoffer og massespektrometri for identifikasjon av protein backbones. Bevaring av slimlaget er men første forutsetning for slike studier.
Mange laboratorier har vevsprøver frosset i OCT som ble samlet inn i fortiden for ulike prosjekter, kan disse vev kan lett brukes til å studere mucins, glycolipids og glycan distribusjon eliminerer behovet for å samle vev i spesielle fiksativ som er designet unikt for slim bevaring. Frosset vev gjennomgår minimal prosessering og derfor naturlig fordeling av glykaner, som er hydratisert i naturen, er bevart. Dette er spesielt viktig i riket av mikrobiell-vert interaksjoner. Kunnskap om naturalistisk distribusjon og overflod av utskilt mucins og de mange sukkerkjedene strukturer dekorere disse "barriere" molekyler vil være sentralt i forståelsen vert forsvar, mikrobiell utnyttelse og pathogeneser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Nicole M. Nemeth (University of Georgia) og Jeanne M. Fair (LANL) for deres hjelp i høstingen kylling vev, og Steven A. Springer for hans hjelp under filmingen. Omsorgen for alle fuglene i denne studien var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer for human bruk av forsøksdyr og alle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer ved Los Alamos National Security, LLC, operatør av Los Alamos National Laboratory under kontrakt No DE-AC52-06NA25396 med det amerikanske Department of Energy. Omsorgen for mus i denne studien er i samsvar med UCSD dyr godkjent protokoll. Humant vev ble oppnådd som en del av UCSD godkjent IRB protokollen. Dette arbeidet ble støttet av stipend 118645 fra University of California Lab Fee President Program (PG) og stipend NS047101 fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (Neuroscience Mikroskopi Felles Facility, UC San Diego).
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |