Não fixadas amostras de tecidos congelados embebidos em meio óptimo de temperatura de corte (OCT) podem ser usados para estudar a distribuição natural e glicosilação de muco secretado. Neste processamento de tecidos abordagem é mínima e a apresentação natural de glicolípidos, mucinas e glicano-epítopos é preservada. As secções de tecido podem ser analisados por imuno-histoquímica utilizando detecção por fluorescência ou cromogénico.
As mucinas são complexos e altamente glicosilada O-linked glicoproteínas, que contêm mais do que 70% em peso de hidratos de carbono 1-3. Mucinas segregadas, produzido pelas células caliciformes e a mucosa gástrica, o andaime para fornecer uma camada de muco micrômetros de espessura, que reveste o epitélio do intestino e do trato respiratório 3,4. Além de mucinas, as camadas de muco também contêm péptidos antimicrobianos, citoquinas, e as imunoglobulinas 5-9. A camada de muco é uma parte importante da imunidade do hospedeiro inato, e forma a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos 8,10-12. Como tal, o muco é objecto de numerosas interacções com micróbios, ambos os patógenos e simbiontes, e mucinas segregadas constituem uma interface importante para estas interacções. O estudo de tais interacções biológicas normalmente envolve métodos histológicos para a recolha de tecidos e de coloração. Os dois mais utilizados métodos histológicos para a recolha de tecidos e preservandoção na clínica e em laboratórios de pesquisa são: a fixação de formalina seguido de parafina e congelamento de tecido, seguido de incorporação em crio-protetores mídia.
Amostras de tecido emblocado em parafina produzir seções com qualidades ideais para a visualização histológica incluindo clareza e bem definida morfologia. No entanto, durante o processo de incorporação de um número de parafina de epitopos se alterou e, a fim de estudar estes epítopos, as secções de tecido têm de ser posteriormente tratados com um dos métodos de recuperação de epítopo de muitas 13. Mucinas segregadas e lípidos são extraídos do tecido durante o passo de compensação inclusão em parafina, a qual requer prolongar a incubação com solventes orgânicos (ou xileno Citrisolv). Portanto, esta abordagem é sub-ótima para estudos sobre a natureza e distribuição de mucinas e muco in vivo.
Em contraste, os tecidos de congelamento na temperatura de corte ótima (outubro) a incorporação de um meiovazios desidratação e limpeza da amostra, e mantém a hidratação da amostra. Isto permite uma melhor conservação da camada de muco hidratada e, assim, permite o estudo das várias funções de mucinas em biologia epitelial. Como este método requer um tratamento mínimo do tecido, o tecido é conservado num estado mais natural. Secções congeladas de tecidos, por conseguinte, não necessitam de qualquer tratamento adicional antes da coloração e pode ser facilmente analisada através de métodos imuno-histoquímicos.
Nós demonstramos a preservação de micrômetros de espessura da camada de muco secretado em amostras de cólon congelados. Esta camada é drasticamente reduzida quando os mesmos tecidos são embebidas em parafina. Também demonstramos coloração por imunofluorescência de epítopos de glicano apresentados em mucinas utilizando lectinas vegetais. A vantagem desta abordagem é a de que ele não requer o uso de fixadores especiais e permite a utilização de tecidos congelados que já podem ser conservadas no laboratório.
Preservação de muco e glicano epítopos em tecidos congelados é superior à dos tecidos que foram embebidos em parafina. Nós demonstramos a preservação da camada de muco secretado (Figuras 1 e 3) e a distribuição de três estruturas de glicanos (Figura 3), em comparação com tecidos congelados embebidos em parafina tecidos. Fixadores especializados, tais como solução de Carnoy (etanol a 60%, clorofórmio a 30%, 10% de ácido acético) 17 ter sido desenvolvido para a conservação óptima da camada de muco em amostras de tecido. Em condições óptimas, esta solução deve ser utilizado para recolher amostras de tecido que são dedicados para estudos de muco e foi mostrado para preservar a aparência lisa da camada de muco 16-17. A camada de muco em amostras congeladas não fixadas incorporado em OCT parece resistente e em algumas áreas pode separar a partir do tecido, no entanto, a espessura de camada total está de acordo com o observado em tecidos que foram fixados com solução de Carnoy e embedded em parafina 16-17. Por exemplo, a camada de muco na secção de tecido do cólon humano congelado é de ~ 100 mm (Figura 1), que está dentro do intervalo descrito para Carnoy's fixo amostra de cólon humano de 55,4 ± 2,5 um (intervalo 7,7-204,8 mm) 16.
Tem sido conhecido durante décadas, que resulta em desidratação de etanol ~ o encolhimento de 30% das amostras biológicas 18, e que os solventes orgânicos tais como xileno e lípidos Citrisolv extracto de clorofórmio, glicolípidos e, em certa medida, das proteínas a partir dos 13 tecidos. Processamento de tecidos para inclusão em parafina inclui as seguintes etapas: fixação (10% de formalina tamponada), desidratação (aumentando a concentração de etanol), e de compensação (Citrisolv ou xileno). Imitando estes passos não fixadas em secções de tecido congeladas, foi demonstrado que Citrisolv extrai muco a partir de secções de tecido congeladas, resultando em morfologia de tecido que é semelhante ao de tecidos embebidos em parafina (Figure 2, painel da direita). Em contraste, a camada de muco não foi alterada pela incubação com formalina ou etanol (Figura 2, para a esquerda e painéis centrais). Isto sugere que a etapa de limpeza de um procedimento padrão inclusão em parafina, o qual requer a incubação prolongada em Citrisolv / xileno, resulta no colapso da camada de muco. Fixação em formalina não danifica a camada de muco e secções congeladas de tecidos que foram fixadas com formalina pode ser facilmente manchado com lectinas e anticorpos contra glicanos, glicolípidos e proteínas (Figuras 2, 3 e 6). Estes efeitos podem ser insignificante para o estudo de proteínas ligadas à membrana e os tecidos patologia, mas eles são devastadoras para as estruturas altamente hidratados, tais como a camada de muco secretado. No entanto estudos histológicos de mucinas são ainda realizados principalmente com amostras embebidas em parafina, nas quais a camada de muco preservação é de qualidade inferior. Em análises aprofundadas de composição do muco camada como a identidade precisa de sicreted ou ligados membrana glicoproteína MUC combinações exigem anticorpos específicos e de espectrometria de massa para a identificação dos esqueletos proteicos. Preservação da camada de muco é, mas a exigência inicial para esses estudos.
Muitos laboratórios têm amostras de tecidos congelados em OCT que foram recolhidos no passado por diferentes projectos, estes tecidos podem ser prontamente usados para estudar as mucinas, glicolípidos e distribuição de glicano eliminando a necessidade de recolha de tecidos em fixadores especiais que são concebidos exclusivamente para a preservação de muco. Tecidos congelados objecto de processamento mínimo e, por conseguinte, a distribuição natural de glicanos, que são hidratados na natureza, é preservado. Isto é especialmente importante no reino do microbiana acolhimento interações. Conhecimento da distribuição e abundância naturalista de mucinas secretadas e as estruturas glicano muitos decorar esses "barreira" moléculas será a chave para a compreensão de defesa do hospedeiro, a exploração microbiana e patógenosé.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Nicole M. Nemeth (University of Georgia) e Jeanne M. Feira (LANL) por sua ajuda na colheita de tecidos de galinha, e Steven A. Springer por sua ajuda durante as filmagens. O cuidado de todas as aves em estudo estava em conformidade com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde para o uso humano dos animais de laboratório e todos os protocolos foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comissões de Uso do Los Alamos National Security, LLC, operadora do Los Alamos Laboratório Nacional sob Contrato n º DE-AC52-06NA25396 com o Departamento de Energia dos EUA. O cuidado de camundongos deste estudo está em conformidade com UCSD protocolo animal aprovado. Tecidos humanos foram obtidos como parte da UCSD protocolo IRB aprovado. Este trabalho foi financiado por bolsa 118645 da Universidade da Califórnia Lab Programa Taxa Presidente (PG) e NS047101 concessão do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (Mecanismo de Microscopia Neuroscience compartilhada, UC San Diego).
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |