Ofixerade frysta vävnadsprover inbäddade i Optimal Cutting Temperature-medium (OCT) kan användas för att studera naturliga distribution och glykosylering av utsöndrat slem. I detta tillvägagångssätt vävnadsbehandling är minimal och den naturliga presentation av glykolipider, muciner och glykan-epitopema bevaras. Vävnadssnitt kan analyseras genom immunhistokemi med användning av fluorescens eller kromogen detektion.
Muciner är komplexa och kraftigt glykosylerat O-bundna glykoproteiner, som innehåller mer än 70% kolhydrat vikt 1-3. Utsöndrade muciner, som produceras av bägarceller och magslemhinnan, ge byggnadsställningen för en mikrometer tjockt slem skikt som linjer epitel i tarmen och luftvägarna 3,4. Förutom muciner, slem skikt innehåller även antimikrobiella peptider, cytokiner, och immunoglobuliner 5-9. Det slemlager är en viktig del av värdens medfödd immunitet, och bildar den första försvarslinjen mot invaderande mikroorganismer 8,10-12. Som sådan, är slem föremål för åtskilliga interaktioner med mikrober, både patogener och symbionter och utsöndrade muciner utgör en viktig gränssnitt för dessa interaktioner. Studiet av sådana biologiska interaktioner innebär vanligtvis histologiska metoder för mjukpapper insamling och färgning. De två vanligaste histologiska metoder för vävnad insamling och preservring på kliniken och i forskningslaboratorier är: formalin fixering följt av paraffininbäddning och vävnader frysning, följt av inbäddning i kryo-skyddsmedel medier.
Paraffininbäddade vävnadsprover producerar delar med optimala egenskaper för histologisk visualisering, inklusive klarhet och väldefinierade morfologi. Men under paraffininbäddning processen ett antal epitoper blir förändras och för att studera dessa epitoper, vävnadssnitten måste bearbetas ytterligare med en av många metoder epitopretrieval 13. Utsöndrade muciner och lipider extraheras från vävnaden under paraffin-inbäddade clearing steg, som kräver förlänga inkubering med organiska lösningsmedel (xylen eller Citrisolv). Därför är detta tillvägagångssätt är optimalt för studier med fokus på natur och distribution av muciner och slem in vivo.
Däremot frysning vävnader i optimal skärtemperaturen (oktober) inbäddningsmedium enhåligheter uttorkning och clearing av provet och upprätthåller provet hydrering. Detta möjliggör bättre bevarande av det hydratiserade slem skiktet, och sålunda medger studiet av de många roller muciner i epitelial biologi. Eftersom denna metod kräver minimal bearbetning av vävnaden, är vävnaden bevaras i ett mera naturligt tillstånd. Därför frysta vävnader avsnitt kräver ingen ytterligare behandling före färgning och kan lätt analyseras med immunohistokemi metoder.
Vi visar bevarandet av mikrometer tjocka utsöndras slemlager i frysta kolon prover. Detta skikt är drastiskt när samma vävnader inbäddade i paraffin. Vi visar också immunofluorescensfärgning av glykan epitoper på muciner med växtlektiner. Fördelen med denna metod är att det inte kräver användning av speciella fixativ och tillåter användning av frysta vävnader som redan kan bevaras i laboratoriet.
Bevarande av slem och glykan epitoper i frusna vävnader är överlägsen den hos vävnader som var inbäddade i paraffin. Vi visade bevarandet av utsöndrad slem skikt (figurerna 1 och 3) och fördelningen av tre glykaner strukturer (figur 3) i frysta vävnader jämfört med paraffininbäddade vävnader. Specialiserade fixativ, såsom Carnoys lösning (60% etanol, 30% kloroform, 10% ättiksyra) har 17 utvecklats för optimal konservering av slemskiktet i vävnadsprover. Optimalt bör denna lösning användas för att samla vävnadsprover som är avsedda för slem studier och visades bevara slätt utseende av slem skikt 16-17. Slem skiktet i ofixerade frysta prover inbäddade i oktober verkar robust och i vissa områden kan lossna från vävnaden, men den totala tjocklek är i överensstämmelse med vad som observerats i vävnader som har åtgärdats med Carnoys lösning och embedded i paraffin 16-17. Till exempel är det slem skiktet i frusen human kolon vävnadssektion ~ 100 nm (figur 1), vilket är inom det område som rapporteras för Carnoy's-fast human kolon prov 55,4 ± 2,5 ^ m (intervall 7,7 till 204,8 um) 16.
Det har varit känt under årtionden att etanol uttorkning resulterar i ~ 30% krympning av biologiska prover 18, och att organiska lösningsmedel såsom xylen, Citrisolv och kloroform lipider extrakt, glykolipider och, i viss utsträckning, proteiner från vävnaderna 13. Tissue behandling för paraffininbäddning innefattar följande steg: fixering (10% buffrad formalin), uttorkning (ökande etanol koncentration) och clearing (Citrisolv eller xylen). Genom att imitera dessa steg på ofixerade frusna vävnadssektioner, visade vi att Citrisolv extraherar slem från frysta vävnadssektioner resulterar i vävnad morfologi som liknar den av paraffininbäddade vävnader (Figure 2, högra panelen). I motsats, var slem skiktet inte ändras genom inkubering med formalin eller etanol (figur 2, vänster och paneler center). Detta tyder på att clearing steget av standard paraffininbäddning förfarande, som kräver långvarig inkubering i Citrisolv / xylen, resulterar i kollaps slemlager. Formalin fixering skadar inte slem skiktet och frysta vävnader sektioner som fixerades med formalin kan lätt färgas med lektiner och antikroppar mot glykaner, glykolipider och proteiner (figur 2, 3 och 6). Dessa effekter kan vara försumbar för studien av membranbundna proteiner och vävnad patologi, men de är förödande för starkt hydratiserade strukturer såsom det utsöndrade slemmet skiktet. Emellertid histologiska studier av muciner fortfarande genomförs mestadels med paraffininbäddade prover, i vilka slem skiktet bevarande är suboptimal. Djupgående analyser av slemlager sammansättning såsom den exakta identiteten av sigcreted eller membranbundna MUC glykoprotein kombinationer kräver särskilda antikroppar och masspektrometri för identifiering av protein stamnät. Bevarande av slemlager är men den initiala kravet på sådana studier.
Många laboratorier har vävnadsprover frysts i oktober som samlats i det förflutna för olika projekt, kan dessa vävnader lätt användas för att studera muciner, glykolipider och glykan fördelning eliminerar behovet av att samla vävnader i speciella fixativ som är unikt för slem bevarande. Frysta vävnader genomgår minimal behandling och därför den naturliga fördelningen av glykaner, som är hydratiserade i naturen, bevaras. Detta är särskilt viktigt i sfären av mikrobiella värd-interaktioner. Kunskap om naturalistisk utbredningen och mängden av utsöndrade muciner och de många strukturer glykan dekorera dessa "barriär" molekyler kommer att vara avgörande för förståelsen värdförsvar, mikrobiell exploatering och patogenerär.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Nicole M. Nemeth (University of Georgia) och Jeanne M. Fair (LANL) för deras hjälp med att skörda kyckling vävnader och Steven A. Springer för hans hjälp under inspelningen. Vården av alla fåglar i denna studie var i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer för human användning av försöksdjur och alla protokoll godkändes av Institutional Animal Care och kommittéer användning vid Los Alamos National Security, LLC, som driver Los Alamos nationellt laboratorium enligt kontrakt nr DE-AC52-06NA25396 med US Department of Energy. Vården av möss i studien är i enlighet med UCSD godkänd djur protokoll. Mänskliga vävnader erhölls som en del av UCSD godkända IRK-protokollet. Detta arbete stöddes av bidrag 118.645 från University of California Lab Avgift President Program (PG) och bidrag NS047101 från National Institute of neurologiska sjukdomar och Stroke (Neuroscience Mikroskopi Delad Facility, UC San Diego).
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |