Optimal Kesme Sıcaklık orta (OCT) gömülü sabitlenmemiş dondurulmuş doku örneklerinin salgılanan mukus doğal dağıtım ve glikozilasyon incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, doku işleme minimal ve glikolipitler, müsin ve glukanıdır-epitopların doğal sunumu korunur. Doku kesitleri floresan veya kromojenik algılama kullanılarak immünohistokimyasal olarak analiz edilebilir.
Mukinler ağırlığı 1-3% 70'den fazla karbonhidrat içeren karmaşık ve ağır glikosilatlıdır O-bağlı glikoproteinler, vardır. Salgılanan müsin, goblet hücresi ve mide mukozası tarafından üretilen, bir mikrometre kalınlığında mukus tabakası için iskele sağladığı hatları bağırsak ve solunum yolu 3,4 epithelia. Müsin ek olarak, mukus tabakalar da antimikrobiyal peptitler, sitokinler ve immünoglobulinler 5-9 içerir. Mukus tabakası konak bağışıklık önemli bir parçası olduğunu ve mikroorganizmaların 8,10-12 istila karşı ilk savunma hattı oluşturur. Bunun gibi, mukus mikropların çok sayıda etkileşimleri tabidir, hem patojenler ve simbiont ve salgılanan müsin bu etkileşimler için önemli bir arayüz oluştururlar. Böyle biyolojik etkileşimin çalışma genellikle doku toplama ve boyama için histolojik yöntemler içerir. Doku toplama ve preserv için iki en yaygın olarak kullanılan yöntemler histolojikklinik ve araştırma laboratuvarlarında ation şunlardır: formalin fiksasyonu kriyo-koruyan medya gömerek ardından, parafine gömme takip ve doku dondurma.
Parafine gömülü doku örneklerinde berraklık ve iyi tanımlanmış morfolojisi gibi histolojik görselleştirme için optimal nitelikler ile bölümleri üretmek. Bununla birlikte, parafin gömme işlemi sırasında epitopunun çok sayıda değiştirilmiş ve bu epitoplara incelemek için, doku kesitleri daha fazla sayıda epitop yöntemlerine de 13 biri ile işlenmesi gereken hale gelir. Salgılanan müsin ve lipitler organik çözücü maddeler (ya da ksilen Citrisolv) ile inkübasyon uzun sürmesi parafin gömme temizleme adımı sırasında doku ayıklanır. Bu nedenle bu yaklaşım müsin ve in vivo mukus niteliği ve dağıtım odaklanan çalışmalar için optimal olduğunu.
Buna karşılık, Optimal Kesme Sıcaklık donma dokuların (OCT) orta bir katıştırmaboşluklar örnek dehidratasyon ve takas ve örnek hidrasyon korur. Bu mukus sulu tabaka daha iyi koruma sağlar, ve böylece epitel biyoloji Müsinlerin çok sayıda rolleri çalışma sağlar. Bu yöntem, doku en az işleme gerektirdiği gibi, doku daha doğal bir durumda muhafaza edilir. Dolayısıyla dondurulmuş doku bölümleri boyamadan önce herhangi bir ek işlem gerektirmez ve kolayca immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak analiz edilebilir.
Biz dondurulmuş kolon örneklerinde mikrometre kalınlığında salgılanan mukus tabakasının korunması göstermektedir. Aynı dokularda parafin içine gömülmüş, bu katman büyük ölçüde azaltılmış olur. Ayrıca bitki lektinler kullanarak müsin sunulan glukanıdır epitopların immünofloresan boyama göstermektedir. Bu yaklaşımın avantajı, özel fiksatif kullanımını gerektirir ve zaten laboratuvarda muhafaza edilebilir dondurulmuş doku kullanan veriyor olmamasıdır.
Dondurulmuş dokularda mukus ve glukanıdır epitoplarının korunması parafine gömüldü dokuların üstündür. Bu mukus salgılanması katman (Şekil 1 ve 3) ve parafine gömülmüş dokulara göre dondurulmuş dokuda üç glukanlardır yapılarının dağılımı (Şekil 3) arasında muhafaza göstermiştir. Bu tür Carnoy çözeltisi gibi özel fiksatifler, (% 60 etanol,% 30 kloroform,% 10 asetik asit) 17 doku numuneleri içinde mukus tabakasının en uygun şekilde korunması için geliştirilmiştir. Optimal, bu çözüm mukus çalışmalar için varız doku örnekleri toplamak için kullanılması gerektiğini ve mukus tabakası 16-17 pürüzsüz bir görünüm korumak için gösterilmiştir. OCT gömülü sabitlenmemiş donmuş örnekleri mukus tabakası sağlam görünür ve bazı alanlarda doku ayırmak olabilir, ancak genel tabakası kalınlığı Carnoy solüsyonu ve embedd ile tespit edilen dokularda gözlenen ile uyum içindedirParafin 16-17 ed. 16 – Örneğin, dondurulmuş insan kolon dokusunda bölümünde mukus tabakası Carnoy's sabit insan kolon Örnek 55.4 ± 2.5 mikron (204.8 mikron aralığında 7.7) için bildirilen aralığında ~ 100 mikron (Şekil 1) 'dir.
Bu, on yıllardır bilinmektedir ki biyolojik numune, 18 ~% 30 büzülme ve dokular 13 ksilen gibi organik çözücüler, Citrisolv ve bir dereceye kadar kloroform ekstresi lipidler, glikolipidler ve, proteinler de etanol dehidrasyon ile sonuçlanır. Fiksasyon (% 10 tamponlu formalin), dehidratasyon (artan etanol konsantrasyonu) ve takas (Citrisolv veya ksilen): parafine gömme için Doku işlem aşağıdaki adımları içerir. Sabitlenmemiş dondurulmuş doku kesitlerinde şu adımları taklit ederek, biz Citrisolv (Figür parafine gömülü dokuların buna benzer doku morfolojisi sonuçlanan dondurulmuş doku bölümlerden mukus ayıklar göstermiştire 2, sağ panel). Buna karşılık, mukus katman (Şekil 2, sol ve orta panel) ya da formalin etanol ile inkübasyon yoluyla değişmemiştir. Bu da gösteriyor ki Citrisolv / ksilen uzamış inkübasyon gerektirir standart parafine gömme prosedürün açıklığa adım, mukus tabakasının çöküşle sonuçlanır. Formalin fiksasyonu kolayca glikan, lipid glikolipitler ve proteinler (Şekil 2, 3 ve 6) karşı lektinler ve antikorlar ile boyanarak edilebilir formalin ile tespit edildi mukus tabakası ve dondurulmuş doku bölümleri zarar vermez. Bu etkiler membrana bağlı proteinler ve doku patolojisinin çalışma için önemsiz olabilir, ama bu tür salgılanan mukus tabakası gibi yüksek nemli yapılar için yıkıcı vardır. Müsinlerin Ancak histolojik çalışmalar hala mukus tabakası korunması suboptimal olduğu parafine gömülü örnekleri, çoğunlukla yapılır. Böyle se kesin kimlik olarak mukus tabakası kompozisyon derinliği analizlerindecreted ya da zar bağlı glikoproteindir MUC kombinasyonları spesifik antikorlar ve protein omurgaları belirlenmesi için kütle spektrometrisi gerektirir. Mukus tabakasının korunması gibi çalışmaları için ancak ilk gerekliliktir.
Birçok laboratuar farklı projeler için geçmişte toplanmıştır OCT dondurulmuş doku örneklerinin, bu dokular kolayca müsin, glikolipid ve mukus korunması için benzersiz tasarlanmış özel fiksatif içine dokuları toplamak için ihtiyacı ortadan kaldırarak glukanıdır dağılımını kullanılabilir olması. Donmuş dokular en az işleme geçmesi ve bu yüzden doğal olarak sulu glikan, lipid doğal dağılımı muhafaza edilir. Bu mikrobiyal-konak ilişkileri aleminde özellikle önemlidir. Bu "bariyer" molekülleri dekorasyon salgılanan müsin ve birçok glukanıdır yapıların natüralist dağılımı ve bolluğu Bilgi konak savunma, mikrobiyal sömürü ve patojenler anlamada anahtar olacakolduğunu.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Tavuk dokuları yardım ettikleri için Nicole M. Nemeth (University of Georgia) ve Jeanne M. Fuarı (LANL) teşekkür ve çekimler sırasında, onun yardım için Steven A. Springer olurdu. Bu çalışmada tüm kuşların bakım Los Alamos Ulusal Güvenlik, LLC, Los Alamos operatörün Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış laboratuvar hayvanları ve tüm protokolleri insani kullanımı için Sağlık kuralları National Institutes uygun oldu Sözleşme kapsamında Ulusal Laboratuvarı ABD Enerji Bakanlığı ile No DE-AC52-06NA25396. Bu çalışmada farelerde bakımı UCSD hayvan onaylanan protokole uygun olduğunu. İnsan doku UCSD onaylı protokol IRB bir parçası olarak elde edildi. Bu çalışma California Lab Ücret Başkan Programı Üniversitesi (PG) ve hibe NS047101 Nörolojik Bozukluklar Ulusal Enstitüsü ve İnme (Nörobilim Mikroskopi Paylaşılan Tesisi, UC San Diego) hibe 118645 tarafından desteklenmiştir.
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |