Este protocolo se centra en la utilización de la capacidad inherente de las células madre para tomar el ejemplo de su matriz extracelular circundante y ser inducidas a diferenciarse en múltiples fenotipos. Este manuscrito métodos extiende nuestra descripción y caracterización de un modelo utilizando un hidrogel bicapa, compuesto de PEG-fibrina y colágeno, a la vez co-diferenciar derivadas de tejido adiposo células madre 1.
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Artículo de método
Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC
En este artículo
Resumen
Resumen
Polímeros naturales en los últimos años han adquirido mayor importancia debido a su biocompatibilidad anfitrión y capacidad de interactuar con las células in vitro e in vivo. Un área de investigación que promete en medicina regenerativa es el uso combinatorio de biomateriales novedosos y células madre. Una estrategia fundamental en el campo de la ingeniería de tejidos es el uso de andamios tridimensionales (por ejemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogeles, micro / nano partículas) de la dirección de la función celular. Esta tecnología ha evolucionado desde el descubrimiento de que las células necesitan un sustrato sobre el que se pueden adherir, proliferan, y expresar su fenotipo diferenciado y función celular 2-3. Más recientemente, se ha determinado también que las células no sólo utilizar estos sustratos para la adherencia, sino también interactuar y tener señales de la matriz de sustrato (por ejemplo, la matriz extracelular, ECM) 4. Por lo tanto, las células y andamios tienen una conexión recíproca quesirve para controlar el desarrollo del tejido, la organización y función última. Derivadas de tejido adiposo células madre (ASC) son mesenquimal, no las células madre hematopoyéticas presentes en el tejido adiposo que puede exhibir múltiples linaje diferenciación y sirven como una fuente disponible de células (es decir, pre-endotelio vascular y pericitos). Nuestra hipótesis es que derivadas de tejido adiposo células madre pueden ser dirigidos hacia diferentes fenotipos de forma simultánea simplemente co-cultivo en matrices de doble capa 1. Nuestro laboratorio está centrado en la curación de heridas dérmicas. Para este fin, se creó una matriz compuesta única de los biomateriales naturales, fibrina, el colágeno, y quitosano que puede imitar las características y funciones de un dermo-específica curación ambiente de la herida de ECM.
Protocolo
1. Aislar derivadas de tejido adiposo células madre (ASC) 1, 5
Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
- Aislar adiposo perirrenal rata y epididimal y se lava con solución estéril de Hank sal tamponada (HBSS) que contenía 1% de suero fetal bovino (SFB) como se ha descrito previamente 5. Este estudio ha sido llevado a cabo en cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal, el Reglamento de ejecución de Bienestar Animal y de conformidad con los principios de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
- Picar el....
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Discusión
ASCs son bien conocidos por su facilidad de aislamiento y la capacidad de diferenciar hacia diversos tipos de células. Con las técnicas descritas en este manuscrito, que son capaces de explotar la plasticidad de la ASC mediante la exposición de estas células para biomatrices múltiples simultáneamente. Como las células migran lejos de su base de CSM y entrar en su entorno extracelular, las células toman el ejemplo de la tarima y puede mantener la "troncalidad" (colágeno) o ser inducidas a diferenciarse hacia ti.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses financieros existen.
Aviso legal
Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son las opiniones particulares de los autores y no deben interpretarse como oficial o que refleja las opiniones del Departamento de Defensa o el Gobierno de los EE.UU.. Los autores son empleados del gobierno de EE.UU., y este trabajo fue preparado como parte de sus funciones oficiales. Todo el trabajo fue apoyado por el Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y el Comando de Material. Este estudio se llevó a cabo en virtud de un protocolo revisado y aprobado por la Investigación Médica del Ejército de EE.UU. y de la Junta de Revisión Institucional de Material de comandos y de acuerdo con el protocolo aprobado.
Agradecimientos
SN fue apoyado por una beca Postdoctoral Fellowship de la Iniciativa de Ingeniería de Tejidos de Pittsburgh. DOZ con el apoyo de una subvención concedida por La Fundación de Ginebra.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumible |
| Suero Bovino Fetal | Hyclone | SH30071.03 | Consumible |
| La colagenasa tipo II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumible |
| 70-m Filtro de malla de nylon | BD Biosciences | 352350 | Consumible |
| 100-m nylon Filtro de malla | BD Biosciences | 352360 | Consumible |
| El crecimiento medio del sistema MesenPRO | Invitrogen | 12746-012 | Consumible |
| L-glutamina | Gibco | 25030 | Consumible |
| CaCl 2 .2 H 2 O | Sigma | C8106 | Consumible |
| T75 frasco de cultivo de tejidos | BD Biosciences | 137787 | Consumible |
| El quitosano | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumible |
| Ácido Acético | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumible |
| N-octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumible |
| Sorbitan mono-oleato | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumible |
| Hidróxido de potasio | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumible |
| Acetona | Fisher Scientific | L-4859 | Consumible |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumible |
| Trinitro bencenosulfónico | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumible |
| Ácido clorhídrico | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumible |
| Éter etílico | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumible |
| 8 micras de tejido Inserta cultivo en placa | BD Biosciences | 353097 | Consumible |
| 1,5 ml Tubos de microcentrífuga | Pescador | 05-408-129 | Consumible |
| Reactivo MTT | Invitrogen | M6494 | Consumible |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumible |
| Qtracker célula Etiquetado Kit (QRastreador de 655) | Sondas moleculares | Q2502PMP | Consumible |
| Colágeno tipo 1 | Travigen | 3447-020-01 | Consumible |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumible |
| 12 placas de cultivo tisular | BD Biosciences | 353043 | Consumible |
| El fibrinógeno | Sigma | F3879 | Consumible |
| La trombina | Sigma | T6884 | Consumible |
| Derivado benzotriazol de polietileno | Sunbio | DE-034GS | Consumible |
| Tampón Tris Tableta (pH 7,6) | Sigma | T5030 | Consumible |
| Centrifugar | Eppendorf | 5417R | Equillo |
| Agitador orbital | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipo |
| Incubador humidificado con Air-5% de CO 2 | Thermo Scientific | Modelo 370 | Equipo |
| Agitador de varillas | IKA | Visc6000 | Equipo |
| Agitador magnético | Corning | PC-210 | Equipo |
| Desecador de vacío | - | - | Equipo |
| Analizador de Tamaño de Partículas | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipo |
| Baño de agua | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipo |
| Espectrofotómetro | Beckman | Beckman Coulter DU Espectrofotómetro 800UV/Visible | Equipo |
| Vórtice | Diagger | 3030a | Equipo |
| Lector de microplacas | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipo |
| Luz / microscopio de fluorescencia | Olimpo | IX71 | Equipo |
| Microscopio Confocal | Olimpo | FV-500 microscopio confocal de barrido láser | Equipo |
| Microscopio Electrónico de Barrido | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipo |
| Microscopio Electrónico de Transmisión | JEOL | JEOL 1230 | Equipo |
Referencias
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S.
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Reimpresiones y permisos
