Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC

Summary

Este protocolo se centra en la utilización de la capacidad inherente de las células madre para tomar el ejemplo de su matriz extracelular circundante y ser inducidas a diferenciarse en múltiples fenotipos. Este manuscrito métodos extiende nuestra descripción y caracterización de un modelo utilizando un hidrogel bicapa, compuesto de PEG-fibrina y colágeno, a la vez co-diferenciar derivadas de tejido adiposo células madre

Abstract

Polímeros naturales en los últimos años han adquirido mayor importancia debido a su biocompatibilidad anfitrión y capacidad de interactuar con las células in vitro e in vivo. Un área de investigación que promete en medicina regenerativa es el uso combinatorio de biomateriales novedosos y células madre. Una estrategia fundamental en el campo de la ingeniería de tejidos es el uso de andamios tridimensionales (por ejemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogeles, micro / nano partículas) de la dirección de la función celular. Esta tecnología ha evolucionado desde el descubrimiento de que las células necesitan un sustrato sobre el que se pueden adherir, proliferan, y expresar su fenotipo diferenciado y función celular ^2-3. Más recientemente, se ha determinado también que las células no sólo utilizar estos sustratos para la adherencia, sino también interactuar y tener señales de la matriz de sustrato (por ejemplo, la matriz extracelular, ECM) ^4. Por lo tanto, las células y andamios tienen una conexión recíproca quesirve para controlar el desarrollo del tejido, la organización y función última. Derivadas de tejido adiposo células madre (ASC) son mesenquimal, no las células madre hematopoyéticas presentes en el tejido adiposo que puede exhibir múltiples linaje diferenciación y sirven como una fuente disponible de células (es decir, pre-endotelio vascular y pericitos). Nuestra hipótesis es que derivadas de tejido adiposo células madre pueden ser dirigidos hacia diferentes fenotipos de forma simultánea simplemente co-cultivo en matrices de doble capa ^1. Nuestro laboratorio está centrado en la curación de heridas dérmicas. Para este fin, se creó una matriz compuesta única de los biomateriales naturales, fibrina, el colágeno, y quitosano que puede imitar las características y funciones de un dermo-específica curación ambiente de la herida de ECM.

Protocol

1. Aislar derivadas de tejido adiposo células madre (ASC) ^{1, 5}

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Aislar adiposo perirrenal rata y epididimal y se lava con solución estéril de Hank sal tamponada (HBSS) que contenía 1% de suero fetal bovino (SFB) como se ha descrito previamente ^5. Este estudio ha sido llevado a cabo en cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal, el Reglamento de ejecución de Bienestar Animal y de conformidad con los principios de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
2. Picar el tejido y transferir 1-2 g en 25 ml de HBSS conteniendo FBS al 1% en un tubo de 50 ml y se centrifuga a 500 g durante 8 minutos a temperatura ambiente.
3. Recoger la capa adiposa de libre flotación del tejido y la transferencia de 125-ml matraz Erlenmeyer y se trata con 25 ml de colagenasa tipo II (200 U / ml) en HBSS durante 45 min a 37 ° C en un agitador orbital (125 rpm). Retire con cuidado la fracción líquida (por debajo del petróleo y la capa de tejido adiposo) por pipetear y filtrar de forma secuencial a través de un 100 - y 70 micras - filtro de malla de nylon m. Centrifugar el filtrado a 500 g durante 10 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante, y lavar el precipitado dos veces con 25 ml de HBSS.
4. Resuspender el sedimento celular en 50 ml de medio de crecimiento (Medio MesenPRO RS basal), complementado con Suplemento MesenPRO Crecimiento RS, antibiótico-antimicótico (100 U / ml de penicilina G, 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina, y 0,25 g / ml de anfotericina B), y 2 mM de L-glutamina y células de pipeta en dos matraces T75 (25 ml / matraz).
5. Cultura de la ASC en un 5% de CO ₂ humidificado incubadora a 37 ° C (paso 2-4 ASC se utilizan para todos los experimentos).

2. Preparación de microesferas de quitosano (CSM)

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

5. Emulsionar una solución acuosa de quitosano (6 ml de w / v 3% de quitosano en 0,5 M de ácido acético) en un 100 ml de una mezcla en fase de aceite consistente en aceite de soja, el n-octanol (1:2 v / v) y 5 % sorbitan mono-oleato (Span 80) emulsionante, utilizando sobrecarga (1700 rpm) y agitación magnética (1000 rpm) simultáneamente en direcciones opuestas. Este método dual de la mezcla que se asegura de micelas formadas desde el principio antes de la reticulación se puede permanecer en la solución y no se deposite en el fondo. Además, la barra magnética agitadora ayudas en DE-agregación de quitosano durante la formación de micelas y la rigidización.
1. Se agita la mezcla se agita continuamente durante aproximadamente 1 hora hasta una estable de agua-en-aceite que se obtiene. Iniciar transversal iónico une con la adición de 1,5 ml de w / v de hidróxido potásico al 1% en n-octanol cada 15 minutos durante 4 horas (24 ml en total)
2. Secar los campos recuperados en un desecador de vacío y analizar sin más trámite. Se puede determinar el tamaño de partícula medio CSM, área de superficie por miligramo, y la unidad de volumen cúbico utilizando un analizador de tamaño de partícula.
3. Para los experimentos posteriores, se lavan los CSM tres veces con agua estéril para eliminar las sales residuales y esterilizar por lavado durante la noche con 5 ml de etanol absoluto.

3. La determinación deel número de grupos amino libres en los CSM

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Determinar el número de grupos amino libres presentes en MCS después de cruz iónico une mediante el bencenosulfónico trinitro (TNBS) ensayo del ácido de Bubnis y Ofner ^6. Incubar 5 mg de microesferas con 1 ml de solución al 0,5% TNBS en un tubo de vidrio de 50 ml durante 4 horas a 40 ° C y hidrolizar con la adición de 3 ml de HCl 6N a 60 ° C durante 2 h.
2. Enfriar las muestras a temperatura ambiente y extraer los TNBS libres mediante la adición de 5 ml de agua desionizada y 10 ml de éter etílico.
3. Calentar una parte alícuota de 5 ml de la fase acuosa a 40 ° C en un baño de agua durante 15 minutos para evaporar cualquier éter residual, enfriar a temperatura ambiente, y se diluye con 15 ml de agua.
4. Medir la absorbancia a 345 nm con un espectrofotómetro utilizando la solución de TNBS sin quitosano y quitosano como blanco de la utilizada para CSM preparación para determinar el número total de grupos amino. Estimación del número de grupos amino libres de la CSM en relación con quitosano.

4. Cargando ASC en CSM

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Equilibrar 5 mg de MCS esterilizados de la sección 2.5 en HBSS estériles durante la noche y agregar a un niño de 8 - tamaño de micras de poro la cultura Plate de Inserción (placa de 24 pocillos).
2. Después de los MCS se han asentado sobre la membrana, cuidadosamente aspire el HBSS y añadir 300 l de medio de crecimiento hacia el interior del inserto y 700 l de medio de crecimiento hacia el exterior del inserto.
3. Volver a suspender las ASC en la concentración adecuada (1 × 10 ⁴ 4 × 10 ⁴⁾ en 200 ul de medio de cultivo y de semillas en el interior de la inserción CSM placa de cultivo. El volumen final de medio de cultivo dentro de la inserción, después de la siembra, es de 500 l.
4. Incubse comió la cabeza de serie ASC en los CSM durante 24 horas en un 5% de CO ₂ humidificado incubadora a 37 ° C.

5. La determinación del porcentaje de carga ASC y la viabilidad celular en los CSM

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Después de la incubación, la pipeta CSM ASC-cargada en un tubo de microcentrífuga estériles 1,5-ml sin alterar las células que han migrado a la membrana de inserción.
2. Eliminar el medio residual y añadir 250 l de medio de cultivo fresco al tubo.
3. A cada tubo, se añaden 25 l de MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazolio] solución (5 mg / ml) e incubar durante 4 h en un 5% de CO ₂ humidificado incubadora a 37 ° C.
4. Después de la incubación, se elimina el medio, añadir 250 l de dimetilsulfóxido, y vórtice de la mezcla durante 2-5 minutos para solubilizar el complejo formazano.
5. Centrifugar el CSM en 2700 gdurante 5 min, pipeta el sobrenadante y determinar su longitud de onda de absorbancia a 570 nm y 630 nm utilizando un lector de placas estándar, de acuerdo con las especificaciones del fabricante MTT.
6. Determinar el número de células asociada con los MCS en relación con los valores obtenidos a partir de números definidos ASC cultivadas para desarrollar una curva estándar.

6. Preparación y caracterización de ASC-CSM incrustada en PEG-geles de fibrina

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Polietileno glicol (PEG) de fibrina (PEG-fibrina) hidrogel preparado por Suggs et al ⁷ por disolución del glutarato succinimidilo modificada con polietilenglicol (PEG; 3400 Da). Usando 4 ml de Tris-solución salina tamponada (TBS, pH 7,8) y el filtro de esterilizar con un filtro de 0,22 micras-justo antes de iniciar el experimento. PEG disuelto sólo es eficaz en esta solicitud para las primeras 3-4 horas.
2. Mezclar 500 ymu; l de caldo de fibrinógeno (40 mg / ml en TBS, pH 7,8) y 250μl de stock de PEG en un pocillo de cultivo de una placa de 6 pocillos y se incuba durante 20 minutos en un 5% de CO ₂ incubador humidificado a 37 ° C. Esta mezcla constituye una relación de concentración molar de 1:10, SG-PEG-SG: fibrinógeno.
3. Tomar 250 l de ASC-CSM a una concentración de 5 mg de CSM, (≈ 2 x 10 ⁴ células) y se mezcla con la solución de fibrinógeno PEGilado.
4. Inmediatamente después, añadir 1 ml de trombina stock (25U/mL) y rápidamente se tritura una o dos veces con la pipeta. Después de mezclar la trombina con el PEG-fibrinógeno, inmediatamente colocar la mezcla de células-gel en una placa de 12 pocillos y se incubaron en un 5% de CO ₂ incubador humidificado a 37 ° C durante 10 min para permitir la gelificación completa. Desde el tiempo de gelificación es rápida, no tratar de mantener la solución de gel dentro de la punta de la pipeta durante más de 5 segundos. El fibrinógeno PEGilado es escindido por la trombina y forma un hidrogel de fibrina PEGilado. Como tales ª,producto e gel final que se conoce como PEG-fibrina.
5. Lavar los geles de PEG-fibrina dos veces con HBSS y se incuba con medio esencial mínimo alfa (α-MEM) suplementado con FBS al 10% en un 5% de CO ₂ incubador humidificado a 37 ° C.
6. Tenga en cuenta la migración de las células de CSM en el gel durante un período de 11 días utilizando técnicas de microscopía de luz.

7. Preparación y caracterización de ASC-CSM incrustada en geles de colágeno

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Mezcla ASC-CSM (5 mg contiene ≈ 2 x 10 ⁴ células) con colágeno tipo 1 (7,5 mg / ml) se extrajo a partir de tendones de cola de rata según el método de Bornstein ⁸ y fibrilar después de ajustar el pH a 6,8 utilizando NaOH 2N.
2. Agregue el fibrilada colágeno-ASC-CSM mezcla a una placa de 12 pocillos y se incuba durante 30 minutos en un 5% de CO ₂ humedadescado incubadora a 37 ° C.
3. Después de la fibrilación completa, incubar los geles de colágeno-ASC-CSM para un máximo de 11 días en un 5% de CO ₂ humidificado incubadora a 37 ° C.
4. Tenga en cuenta la migración de las células de CSM en el gel durante un período de 11 días utilizando técnicas convencionales de microscopía.

8. Desarrollo de la bicapa PEG-fibrina (ASC-CSM) Las construcciones de gel de colágeno-

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Para desarrollar la bicapa de construir, preparar tanto el colágeno y los geles de PEG-fibrina como se ha descrito anteriormente, con ligeras modificaciones. En pocas palabras, para estudiar las propiedades migratorias y de cooperación por inducción de una sola fuente de células madre utilizando dos matrices biodegradables, "sandwich" de la ASC-MCS, entre el colágeno y los andamios de PEG-fibrina mediante un proceso de cuatro pasos: 1) La carga ASC en CSM, 2) echó gel de colágeno fibrilada y la capa de las perlas de ASC-CSM sobre la collagen gel, 3) reparto de PEG-gel de fibrina sobre el gel ASC-CSM-colágeno y permitir gel a solidificar, y 4) se añade medio para insertar y así para estudiar células in vitro o eliminar de inserción para aplicaciones in vivo (véase la Figura 1 ).
2. Preparar un tipo 1-1 ml de colágeno (7,5 mg / ml) mezcla como se describió anteriormente en 7,1, sin añadir ASC-CSM a la mezcla. Colocar la mezcla en un inserto de tejido 6-pocillos (8-micras de tamaño de poro) y se incuba durante 30 minutos en un 5% de CO ₂ incubador humidificado a 37 ° C.
3. Después de fibrilación completa capa, sobre la superficie de colágeno 5 mg de ASC-CSM (10, 000 células / mg) en suspensión en medios de cultivo (200 l). Después de las microesferas se han asentado sobre el gel, preparar el gel de fibrina-PEG como se describe en la sección 6.0, sin añadir ASC-CSM a la mezcla, y la capa PEGilado fibrinógeno / trombina solución sobre las capas ASC-CSM-colágeno. Al preparar el gel de fibrina-PEG, utilizar 250 l de medio de cultivo celular en lugar de tél 250 l de medio que contiene las células.
4. Una vez completado, se incuban las construcciones de 30 minutos en un 5% de CO ₂ humidificado incubadora para lograr la gelificación completa antes de alimentar a la construcción con el medio de cultivo.
5. Después de la gelificación completa, coloque 1 mL de medio en la cámara alta sobre la construcción y 3 ml de medio en la cámara baja.

9. La materialización de soluciones de archivo

Nota: Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

• Acciones de cloruro de calcio (40 mM): Utilice sólo CaCl ₂ .2 H ₂ O. Disolver 588,4 mg de CaCl ₂ .2 H ₂ O con 100 ml de agua desionizada. Esterilizar utilizando un filtro de 0,22-micras.
• Polietilenglicol: PEG es altamente reactivo con el oxígeno y puede oxidarse cuando se exponen al aire ambiental. Como tal, el PEG se deben almacenar en atmósfera de nitrógeno (N ₂₎ atmósfera. Accurately pesan 32 mg en un tubo de centrífuga de 2 ml (asegúrese de purgar los tubos con el N ₂ antes de su uso) y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su uso. Disolver 32 mg de PEG en 4 ml de solución de TBS antes de su uso.
  Las siguientes soluciones deben ser fresca antes de cada experimento.
  
• TBS solución: (pH 7.75-7.77 a 25 ° C; pH a 25 ° C es muy crítico). Para preparar 15 ml de solución de TBS, cuidadosamente disolver una tableta tampón en esterilizada por filtración de agua desionizada y ajustar el pH a requerida. No guarde la solución madre de preparar fresca cada vez.
• Solución de fibrinógeno: (40 mg / ml). Disolver polvo fibrinógeno en TBS para hacer la concentración de fibrinógeno de 40 mg / ml. Disolver que durante la noche utilizando un agitador magnético a 4 ° C. Es más fácil de disolver el entero 1-g cantidad con la cantidad requerida de TBS. El día siguiente, eliminar el fibrinógeno a partir de 4 ° C (generalmente turbia) y permitir quepara calentar en un baño de agua hasta una solución homogénea. Por último, filtrar esterilizar el fibrinógeno utilizando un filtro de 0,45-micras.
• Solución de trombina (25 unidades / ml): Para hacer la solución de trombina, pésese la cantidad requerida y se disuelven con la preparada 40 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O. Siempre es una buena práctica utilizar el vial entero de la trombina para hacer el caldo. Ejemplo: Disolver una botella de 5 kU trombina con 200 mM de CaCl ₂ .2 H ₂ O, alícuota y almacenar a -20 ° C.

10. Los resultados representativos

El objetivo general de la técnica que aquí se presenta es demostrar el potencial de la matriz simultánea basada en la diferenciación de ASC en fenotipos múltiples usando CSM como vehículo de entrega. Se demuestra una estrategia in vitro para entregar las células madre de los CSM en una bicapa de colágeno-PEG-matrices de fibrina. Caracterización de ASC incrustado dentro de este reveale andamiod que ASC-cargados MCS puede ser "sandwich" entre una capa de colágeno y PEG-fibrina simultáneamente y diferencialmente tomar ejemplo de ambos ambientes extracelulares a prosperar bajo sus nuevas condiciones. En primer lugar, caracteriza la capacidad para el sistema modelo para mantener la viabilidad celular y la capacidad migratorias. El colágeno apoyó la capacidad de CSA para mantener su "troncalidad", como fue demostrado por su expresión de Stro-1 y su morfología similar a fibroblastos (Figura 2D y 2F). En contraste, el PEG-fibrina inducida los ASCs para diferenciar hacia un fenotipo vascular, como se demuestra por su morfología estructura similar a un tubo, su endotelial de células específicas de expresión del factor de von Willebrand (2E y 2G Figura), y pericitos expresión específica de factor de NG2 y plaquetas de crecimiento derivado del receptor beta (PDGFRβ) (datos no presentados). Además, estos fenotipos observados parecen ocurrir a principios de la cultura y se mantuvieron durante 11 días, como es demtrado en la Figura 3.

Tablas y Figuras

Beneficios de la bicapa de constructo:

• La sola andamio sin células pueden actuar como un andamio bioactivo.
• PEG-fibrina puede inducir a las células madre para diferenciar sin la adición de factores de crecimiento.
• El colágeno puede ayudar en el mantenimiento del fenotipo de células madre de la ASC.
• Un constructo bicapa puede ser utilizado como un sustrato activo para otros tipos de células a migrar y proliferar (por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, queratinocitos, células musculares lisas, pericitos).
• Se puede utilizar con andamios de ingeniería de los tejidos duros como los huesos hydroxyaptite o desmineralizada para regenerar el tejido duro y blando.
• Puede ser utilizado para desarrollar una de varias capas, diverso tejido modificado construcción (como dermo-vascular, vascular epitelial, dermo-hipodérmica vascular, etc.)
• Se utiliza una sola fuente de células para desarrollar simultáneamentecompartimentos multicelulares.
• Esto tiene el potencial para la integración con el tejido huésped, ya que es de origen natural.
• CSM dentro de la construcción de gel proporciona una plataforma para que las células migran de.
• El quitosano, utilizado para preparar CSM, es un bien conocido activa quimio-atrayente.
• El concepto general se aplica en este protocolo de "matriz impulsada por la diferenciación de células madre" se puede aplicar a otros tipos de células madre. Sin embargo, debe ampliarse la investigación para determinar la viabilidad de la matriz basada en la diferenciación. La bicapa andamio gel puede actuar como un depósito para entregar las células en una forma sostenida y controlada.
• Después de la reconstrucción, los geles todavía se puede separar en sus componentes individuales.

Figura 1. Esquemático que representa el objetivo general y el proceso de la técnica. 1) derivadas de tejido adiposo de células madre (ASC) se heADED en quitosano microesferas. 2) El colágeno se vierte entonces en un inserto 6-así, el pH se ajustó a fibrilar del colágeno, y el inserto se coloca en una cámara de placa de 6 pocillos. Las esferas CSM ASC-cargadas son entonces en capas sobre el colágeno. 3) El fibrinógeno PEGilada se vierte entonces sobre el colágeno (ASC-CSM) y gelifica mediante la adición de trombina. 4) El constructo bicapa final puede ser retirado de la inserción cultivo y se utiliza para in vitro o in vivo en el análisis.

Caracterización de la Figura 2. De ASC cultivadas en colágeno y fibrina PEG-3D matrices. A) Fase de contraste de microfotografía de pasajes aislados ASC y mantenido mediante la rutina de 2 dimensiones técnicas de cultivo celular. Fotomicrografías B, D y F representan ASC-CSM cultivaron en un gel de colágeno 3-dimensional, mientras que C, E y G muestran ASC-CSM cultivaron en un 3-dimensional de PEG-gel de fibrina, tanto en el día 12. En B y C), ASC se muestran migrar fuera de la esfera CSM en ambos tipos de andamios. ASC parecen tener un aplanado, de tipo huso morfología en colágeno (B), manteniendo al mismo tiempo su expresión del marcador de células madre Stro-1 (D; flecha). Cuando se cultiva en PEG-fibrina ASCs exhiben más estructuras tubulares y son inducidos a expresar estos marcadores de células vasculares como factor von Willebrand (E). Microscopía electrónica de transmisión muestra la morfología típica demostrada por ASC dentro de cada andamio. ASC en gel de colágeno parecen tener menor filopodios (FL) que se extiende desde el cuerpo de la célula (F), mientras que ASCs forman típicamente lumenal (con la etiqueta L) estructuras (G; flecha).

Figura 3. El análisis morfológico de ASC-MCS, entre las bicapas de colágeno y geles de PEG-fibrina. ASC-MCS, se "sándwich" entre el colágeno y los geles de PEG-fibrina y se mantienen en cultivo durante 11 días. La izquierda Column representa la migración y la proliferación de ASC dentro de la matriz de colágeno y parece tener una morfología de tipo huso. La columna de la derecha muestra ASC migran fuera de los MCS y la formación de estructuras tubulares en todo el gel de fibrina-PEG.

Discussion

ASCs son bien conocidos por su facilidad de aislamiento y la capacidad de diferenciar hacia diversos tipos de células. Con las técnicas descritas en este manuscrito, que son capaces de explotar la plasticidad de la ASC mediante la exposición de estas células para biomatrices múltiples simultáneamente. Como las células migran lejos de su base de CSM y entrar en su entorno extracelular, las células toman el ejemplo de la tarima y puede mantener la "troncalidad" (colágeno) o ser inducidas a diferenciarse hacia tipos de células vasculares-vasculares y de apoyo (fibrina). Desde nuestro laboratorio está interesado en la piel y tejidos blandos cicatrización de las heridas, que han aplicado estratégicamente una bicapa de colágeno y fibrina ya que el colágeno ayuda a la regeneración dérmica y epidérmica por el anfitrión, mientras que la fibrina, naturalmente induce la formación de red vascular ^9. Además, ahora se entiende que la diafonía se produce entre la proliferación de queratinocitos, fibroblastos de la piel, y la red vascular subyacente; y complejo estemecanismo es muy crítico para la cicatrización de las heridas ^10. Sin una red vascular subyacente, ingeniería tisular injertos de piel tienen dificultades para inosculating con el tejido del huésped. Por lo tanto, nuestra hipótesis general es que el colágeno y la fibrina, cuando se utiliza como una bicapa en combinación con ASC, disminuirá tiempos de curación de heridas por mejorar una o más etapas de vaso sanguíneo, dérmica, y los procesos de re-epitelización.

La fibrina es un biopolímero versátil formado después de la trombina mediada por la escisión de fibrinopéptido A derivada de fibrinógeno monomérica. La fibrina se ha utilizado clínicamente como un agente hemostático (aprobado por los EE.UU. Food and Drug Administration) y como sellador en una variedad de aplicaciones clínicas, incluyendo procedimientos como la disección de los tejidos blandos. Hidrogeles de fibrina de fibrinógeno purificado alogénico comercial y la trombina se han utilizado ampliamente en la última década en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos. Sin embargo, algunos inconvenientes principales in utilizando un hidrogel de fibrina puede ser: 1) el potencial para el andamio para reducir el tamaño, 2) baja rigidez mecánica, y 3) una degradación rápida antes de la formación adecuada de las estructuras de ingeniería tisular. Para superar estos problemas, la fibrina necesita ser modificado antes de su uso para servir como una mejor tridimensional de ingeniería de tejidos andamio. Uno de estos métodos se copolimerización de la fibrina con polietileno glicol (PEG-fibrina). Nuestro trabajo preliminar ha demostrado varias características únicas de PEG-fibrina que hacen que sea ventajosa en la curación de heridas en los apósitos de hidrogel, incluyendo la fibrina sin modificar. Pegilado y fibrina presenta características únicas de los dos hidrogeles sintéticos y materiales naturales. Específicamente, la presencia de PEG proporciona un altamente hidratado (> 90% de agua) ambiente húmedo para la gestión de exudados. En segundo lugar, la presencia de fibrina confiere biodegradabilidad del material, sin embargo, los resultados anteriores muestran que la fibrina PEGilado es significativamente más estable in vitro que la fibrina unPEGylated

El segundo componente de nuestra bicapa es el colágeno. El colágeno es un biomaterial naturales expresión ubicua en mamíferos y sirve como un sitio de unión directa para varios tipos de células. Diferentes tejidos expresar diferentes tipos de colágeno (tipo 1-type29), dependiendo del tipo de necesidad funcional del tejido. Otras propiedades inherentes de colágeno que lo hacen muy atractivo en nuestro modelo son que 1) es no-inflamatoria, 2) ambos componentes enteros y degradados de colágeno son biocompatibles, 3) es un hidrogel altamente porosa, 4) que soporta la infiltración de células y la migración, 5) se mantiene multipotencia de células madre, 6) se puede ajustar mediante la formulación de modulación, y 7) que fácilmente inosculates con el tejido del huésped. Para nuestros estudios en la regeneración de la piel y tejidos blandos, un compuesto bicapa formado por colágeno es una elección natural, ya queque es altamente expresado en toda la piel, incluyendo profundas regiones dérmicas, y puede ser utilizado como un marcador de inmunohistoquímica para evaluar la profundidad de una herida.

En este protocolo, se demuestra una técnica para mantener al mismo tiempo "troncalidad" de la ASC, mientras que la diferenciación ASC hacia diversos tipos de células vasculares. Para el estudio de la piel y su tejido blando subyacente, el colágeno y la fibrina PEG-son directamente aplicables. Sin embargo, otros materiales bioscaffold se pueden implementar para estudiar sus habilidades únicas para explorar inducir la ASC en otros tipos celulares. La técnica implementada aquí ayuda a resaltar la importancia de la matriz extracelular en el control de fenotipos de células madre y le da credibilidad a la exploración de los materiales compuestos en capas para la regeneración de la piel.

Resumen

Pasos críticos

• El colágeno se debe ajustar a su pH correcto isoeléctrico (pH 6,8-7.1) para inducir la fibrilación y obtener un gel estable structure.
• PEG debe prepararse poco antes de mezclar con la solución de fibrinógeno ya que la vida útil de PEG acuosa es corto (4-5 horas).
• El tiempo de incubación de la mezcla de fibrinógeno-PEG no debe exceder de 25 minutos (a 37 ° C) ya que el exceso de incubación puede causar una precipitación opaca turbia durante la gelificación.
• Después de la adición de trombina a la disolución de fibrinógeno PEGilado, la mezcla debe ser dispensado a los insertos de cultivo inmediatamente (tras mezclar suavemente con una pipeta). Manteniendo la mezcla en solución en la punta de la pipeta para un tiempo más largo (> 30 seg) puede causar la gelificación dentro de la punta de la pipeta y la dificultad en la obtención de geles uniformemente vertido.
• El uso de células de tamaño uniforme microesferas y se distribuye uniformemente sobre la cama CSM es crítico para la carga óptima de la célula. CSM variación de tamaño de diámetro influye directamente en la superficie disponible para la fijación de células por miligramo de microesferas, mientras que distribuye uniformemente ASC-CSM influye directamente en la migración celular en tque los andamios. La célula microesferas cargadas (ASC-CSM) debe ser distribuido uniformemente en la parte superior del gel de colágeno para asegurar una migración de ASC dentro del andamio. Si la distribución de ASC-MCS es demasiado densa, la migración de células se concentró para obtener un área particular dentro de los geles y puede limitar la interacción célula-célula posterior a la migración.
• Asegurarse de que el volumen de los medios añadió al pocillo exterior del inserto cultivo celular es mayor que el menisco del interior también. Típicamente, un interior: relación de volumen exterior de 1:2 es adecuada, ya que esto facilita células unir a las microesferas.

Limitaciones

• Este método está limitado a la superficie total disponible en las microesferas. Si un número mayor de células se desea, más microesferas son necesarios para aumentar la superficie.
• Dado que las células están destinadas a migrar de microesferas, un retardo de tiempo se puede observar por la migración inicial de células sobre y dentro de los geles.
• Las microesferas están en la interfaz de dos geles (colágeno y PEG fibrina-), y esto puede limitar / tardará más tiempo para la migración de las células a los extremos distales de los geles.
• Durante la construcción de la bicapa, PEGilado fibrinógeno-trombina mezcla tiene que ser añadido rápidamente sobre un lecho CSM-ASC en la parte superior de colágeno. Esto puede causar desigual redistribución de la ASC-CSM. En caso de redistribución desigual de ASC-MCS en la interfase durante el PEG-gel de fibrina de colada, el constructo de gel puede ser lentamente agitada manualmente para redistribuir rápidamente las microesferas antes de la gelificación completa.
• Este método está limitado a las células que tienen propiedades migratorias y puede no ser adecuado para entregar tipos de anclaje independientes de las células.
• La solución de colágeno antes de fibrilación permanece en pH ácido y limita la mezcla directa de las células dentro de geles de colágeno. Como tal, si no se ajustan en un plazo razonable (~ 30 min), la viabilidad celular puede verse comprometida.
• Desde la gELS utilizados en esta construcción son individualmente en capas, una posible interrupción o separación de los geles pueden ocurrir durante el proceso de tratamiento. Por lo tanto, puede limitar la facilidad en el manejo durante los estudios in vivo.

Posibles Modificaciones

• ASC-MCS puede ser distribuido uniformemente dentro de los geles individuales en lugar de capas de ellos en la interfase.
• ASC puede ser directamente en común en geles individuales en lugar de la entrega por el CSM, pero esto puede limitar el desarrollo de las altamente organizadas de células de tejidos estampados construcciones.
• Para evitar desigual redistribución de ASC-MCS durante el PEG-fibrina de colada, el ASC-MCS puede ser suspendido en un pequeño volumen de solución acuosa de quitosano (1% w / v) y se distribuye uniformemente sobre geles de colágeno. Esto garantizará una firme unión de ASC-CSM sobre la capa de gel de colágeno y evitar el desplazamiento de ASC-CSM de la superficie de colágeno.
• La construcción en sí misma puede ser utilizada en una forma invertida, es decir, PEG-fgeles ibrin se podrá votar primero y ASC-CSM puede ser la semilla en la parte superior de la PEG-geles de fibrina seguido de geles de colágeno. Si lo hace, permite al usuario para emitir la solución de colágeno fibrilada sobre la capa (ASC-CSM)-PEG-fibrina más precaución ya que, a diferencia de PEG-fibrina geles, solución de colágeno fibrilada requiere tiempo adicional (30 minutos) para solidificar. Mediante la adopción de este proceso se puede asegurar de mantener una distribución uniforme de ASC-CSM.
• Los geles (colágeno y / o geles de PEG-fibrina) se pueden incorporar con mitógenos, como factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento del endotelio vascular, factores de crecimiento de fibroblastos), así como para inducir la migración más rápida y la proliferación celular.

Solución de problemas

• Durante la fibrilación de la solución de colágeno, si el pH excede el pH isoeléctrico de> 7,2, el pH debe ser reajustado por cualquiera de la adición de más solución madre de colágeno, un descenso del pH utilizando una solución de ácido débil.
• Cuando se prepara el CSM, si una gran variación en el tamaño de ocupaciónRS, a continuación, una serie de parámetros puede ser ajustada para producir el tamaño deseado CSM (viscosidad de quitosano solución madre, el volumen de agente tensioactivo, velocidad de agitación, etc.)
• En el caso de la migración celular lento al rellenar los geles, un mayor número de ASC-MCS, se puede utilizar para aumentar el número de células que migran fuera de la CSM en geles.
• El proceso de gelificación de PEG-fibrinógeno puede ser retardado por limitar el volumen de la trombina añadida a la mezcla (típicamente 900 l en lugar de mL 1) o la preparación de un stock de menor concentración de trombina (20 U / ml en lugar de 25 U / ml) . Esto permite más lenta de gelificación de la mezcla de PEG-fibrinógeno y por lo tanto, da más tiempo para la fundición de cuidado de la pegilado-fibrinógeno y la trombina sobre la mezcla de ASC-CSM.
• Durante la incubación, si se produce una separación de fases (entre el colágeno y el gel de fibrina), un anillo de teflón estéril "O" se puede colocar en el constructo superior para asegurar la sujeción de las fases de gel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO, by Life Technologies	14175	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Consumable
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6685	Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Consumable
MesenPRO Growth Medium System	Invitrogen	12746-012	Consumable
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030	Consumable
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C8106	Consumable
T75 Tissue Culture Flask	BD Biosciences	137787	Consumable
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consumable
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Consumable
N-Octanol	Acros Organics	150630025	Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate	Sigma-Aldrich	S6760	Consumable
Potassium Hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767	Consumable
Acetone	Fisher Scientific	L-4859	Consumable
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741	Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid	Sigma-Aldrich	P2297	Consumable
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	320331	Consumable
Ethyl Ether	Sigma-Aldrich	472-484	Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts	BD Biosciences	353097	Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Consumable
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655)	Molecular Probes, Life Technologies	Q2502PMP	Consumable
Type 1 Collagen	Travigen	3447-020-01	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Consumable
12-Well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	Consumable
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F3879	Consumable
Thrombin	Sigma-Aldrich	T6884	Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene	Sunbio	DE-034GS	Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6)	Sigma-Aldrich	T5030	Consumable
Centrifuge	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Model 370	Equipment
Overhead Stirrer	IKA	Visc6000	Equipment
Magnetic Stirrer	Corning	PC-210	Equipment
Vacuum Desiccator	-	-	Equipment
Particle Size Analyzer	Malvern Instruments	STP2000 Spraytec	Equipment
Water Bath	Fisher Scientific	Isotemp210	Equipment
Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer	Equipment
Vortex	Diagger	3030a	Equipment
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Equipment
Light/Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	IX71	Equipment
Confocal Microscope	Olympus Corporation	FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope	Equipment
Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Leo 435 VP	Equipment
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEOL 1230	Equipment