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Immunology and Infection

Fluorogenic DNAzymes का प्रयोग जीवाणु की जांच

doi: 10.3791/3961 Published: May 28, 2012

Summary

हमने हाल ही में fluorogenic DNAzyme जांच है कि जीवाणु का पता लगाने के लिए एक सरल, फ्लोरोसेंट परख "मिश्रण और पढ़ने" करने के लिए सेट करने के लिए लागू किया जा सकता है पैदा करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण की सूचना दी. इन विशेष डीएनए जांच क्रोमोफोर संशोधित डीएनए शाही सेना कच्चे कोशिकी (यूके) मिश्रण एक विशिष्ट जीवाणु, जिससे बैक्टीरिया का पता लगाने प्रतिदीप्ति संकेत पीढ़ी में अनुवाद के द्वारा उत्पादित की उपस्थिति में chimeric सब्सट्रेट की दरार को उत्प्रेरित. हम इस रिपोर्ट में कुंजी प्रयोगात्मक प्रक्रिया है जहां एक विशिष्ट DNAzyme "RFD-EC1" चिह्नित जांच मॉडल जीवाणु का पता लगाने के लिए कार्यरत है का वर्णन करेंगे,

Protocol

1. रासायनिक समाधान की तैयारी

  1. 0.5 एम ईथीलीन diaminetetraacetic एसिड (EDTA): एक 2 लीटर (एल) प्लास्टिक बीकर, 186.1 छ EDTA (EM विज्ञान) तौलना और autoclaved विआयनीकृत - आसुत पानी (DDH 2 हे) के 800 मिली लीटर (एमएल) जोड़ें. पीएच 8.0 NaOH छर्रों (EM विज्ञान) का उपयोग करने के लिए समायोजित करें. अंतिम मात्रा 1 एल DDH 2 ओ का उपयोग करें 4 डिग्री सेल्सियस पर कांच की बोतलें, आटोक्लेव और दुकान के समाधान स्थानांतरण
  2. 10 × Tris borate EDTA (10 × tbe, 89 मिमी, Tris, 89 मिमी बोरिक एसिड, 2 मिमी EDTA, 7.5 पीएच) समाधान: Tris आधार के 432 छ (BioShop कनाडा) और बोरिक एसिड (BioShop कनाडा) के 220 ग्राम वजन , और एक 4 एल प्लास्टिक बीकर प्रत्येक जोड़ें. उपाय 0.5 एम EDTA (8.0 पीएच) के 80 मिलीलीटर और बीकर करने के लिए जोड़ने. 4 एल अंतिम मात्रा एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ अच्छी तरह से समाधान का मिश्रण जब तक घटकों को पूरी तरह भंग कर रहे हैं DDH 2 हे जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर कांच की बोतलें, आटोक्लेव और दुकान के समाधान स्थानांतरण
  3. 10% polyacrylami denaturingडी जेल शेयर: 4 एल प्लास्टिक बीकर, 1,681.7 ग्राम यूरिया की (BioShop कनाडा), 10 के 400 एमएल × tbe, 40% / acrylamide bisacrylamide (29:1) समाधान (BioShop कनाडा) के 1 एल जोड़ने. DDH 2 ओ के साथ 4 एल मात्रा समायोजित सरगर्मी के साथ यूरिया भंग. 1 एल एम्बर कांच की बोतलें और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान स्थानांतरण (Caution! Acrylamide दस्ताने, मास्क, काले चश्मे और प्रयोगशाला कोट के साथ संभाला जाना चाहिए क्योंकि यह एक polymerization से पहले neurotoxin है).
  4. 2 × जेल लोड हो रहा है (2 × GLB) बफर करने के लिए: एक 200 एमएल कांच बीकर, के 44 ग्राम यूरिया, sucrose के 8 जी (BioShop कनाडा), bromophenol नीला (BioShop कनाडा) के 10 मिलीग्राम, 10 मिलीग्राम xylenecyanol एफएफ (सिग्मा जोड़ने ) Aldrich, 10% सोडियम dodecyl के सल्फेट के 400 μL (एसडीएस, BioShop कनाडा), और 10 × tbe की 4 एमएल. DDH 2 हे के साथ 40 एमएल अंतिम मात्रा समायोजित करें और हल्के (50 डिग्री सेल्सियस) हीटिंग और एक चुंबकीय पट्टी के साथ सरगर्मी के साथ ठोस भंग. 1.5 एमएल microcentrifuge के ट्यूब और दुकान में 4 में 1 एमएल अशेष भाजक स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस हमारे पर आधारितअनुभव, यह 90 में डिग्री सेल्सियस से पहले का उपयोग करें, क्योंकि 2 × GLB भंडारण शर्त के तहत solidifies, 2 गर्मी × GLB संक्षिप्त करने के लिए आवश्यक है.
  5. 1 Tris - एचसीएल एम (7.5 पीएच): एक 200 एमएल कांच बीकर में Tris आधार के 12.1 ग्राम वजन. DDH 2 हे के 60 एमएल जोड़ें और एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ सरगर्मी से ठोस भंग. 7.5 एम 1 एचसीएल (सिग्मा Aldrich) का उपयोग करने के लिए पीएच को समायोजित करें. DDH 2 हे के साथ 100 एमएल मात्रा और एक कांच की बोतल और आटोक्लेव हस्तांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  6. 5 एम NaCl: कांच बीकर में NaCl (BioShop कनाडा) के 58.4 ग्राम वजन और DDH 2 ओ के 150 एमएल के साथ भंग 200 एमएल के लिए DDH 2 ओ के साथ मात्रा समायोजित 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कांच की बोतल, आटोक्लेव, और दुकान के समाधान स्थानांतरण
  7. डीएनए क्षालन बफर: एक गिलास बीकर में, 2 एमएल मिश्रण 1 Tris - एचसीएल एम (7.5 पीएच), 5 एम NaCl 8 एमएल और 0.5 एम EDTA (8.0 पीएच) के 0.4 एमएल. 200 एमएल के लिए DDH 2 ओ के साथ मात्रा समायोजित और सेल्सियस 4 में आटोक्लेव दुकान
  8. 2 × प्रतिक्रिया बफर (2 आरबी ×, 100 मिमी HEPES, 300 मिमी NaCl, 30 मिमी 2 MgCl): एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब (बी फाल्कन), 1.2 HEPES की छ (BioShop कनाडा), NaCl की 0.88 ग्राम और 0.30 MgCl के 2 जी 2 • 6 हे जोड़ने (ईएमडी रसायन) और DDH 2 ओ के 30 एमएल मिश्रण हल्का मिलाते हुए जब तक घटकों को पूरी तरह भंग कर रहे हैं. 7,5 10 एन NaOH समाधान जोड़कर पीएच को समायोजित करें और 50 एमएल के लिए DDH 2 ओ के साथ अंतिम मात्रा को समायोजित 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सिरिंज संचालित फिल्टर (0.22 माइक्रोन, Millipore) के यूनिट और स्टोर का उपयोग करते हुए समाधान शुद्ध
  9. Luria Bertani रसा (पौंड): एक बीकर में, लेग पाउडर के 20.0 ग्राम वजन (सिग्मा Aldrich) 1 DDH 2 ओ एल के अलावा के बाद एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ अच्छी तरह से समाधान का मिश्रण, एक शंक्वाकार फ्लास्क समाधान हस्तांतरण. समाधान और कमरे के तापमान पर दुकान आटोक्लेव.
  10. 1.5% लेग अगर: 250 एमएल कुप्पी में अगर (BioShop कनाडा) के 1.5 ग्राम वजन और तरल लेग के 100 एमएल जोड़ें. मिश्रण और कमरे के तापमान पर दुकान आटोक्लेव.
  11. अगर चढ़ाना: मेलटी लेग अगर एक माइक्रोवेव में और शांत ~ 50 ° सी. करने के लिए समाधान एक लौ के तहत पेट्री डिश (फिशर साइंटिफिक) में समाधान डालो. हमारे अनुभव में, अगर लेग के 100 एमएल 5-6 प्लेटें उपज कर सकते हैं.

2. RFD-EC1 और टेम्पलेट द्वारा RFSS1 के निर्माण Enzymatic Ligation मध्यस्थता

RFD EC1 (छवि 2A) विशेष रुप से प्रदर्शित DNAzyme है. यह उत्प्रेरक अनुक्रम EC1 और सब्सट्रेट अनुक्रम fs1 (चित्र. 2A में काले और हरे रंग की लाइनों द्वारा इंगित) के होते हैं. RFSS1 (छवि 2A) RFD-EC1 के तले संस्करण उत्प्रेरक अनुक्रम EC1 आंशिक रूप से SS1 में फेरबदल है, लेकिन fs1 भाग अपरिवर्तित बनी हुई है. RFD-EC1 और RFSS1 के टेम्पलेट द्वारा किए गए EC1 oligonucleotide या SS1 बंधाव टेम्पलेट के रूप में LT1 की उपस्थिति में oligonucleotide fs1 के enzymatic बंधाव मध्यस्थता (चित्र. 2A में डाला देखें बॉक्स). बंधाव प्रतिक्रिया आयोजित करने के लिए प्रक्रिया नीचे प्रदान की जाती है.Fs1 येल विश्वविद्यालय में उबकना Oligo संश्लेषण से प्राप्त किया गया था, deprotected और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शुद्ध एक पहले से स्थापित प्रोटोकॉल के बाद 17-24 SS1 EC1, और LT1 एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से खरीदे गए थे और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शुद्ध.

  1. Fs1, EC1 SS1, और LT1 के 100 माइक्रोन स्टॉक समाधान DDH 2 ओ का उपयोग कर तैयार -20 डिग्री सेल्सियस पर उन का उपयोग करें जब तक की दुकान.
  2. दो 1.5 μL microcentrifuge ट्यूबों 1 ट्यूब और 2 ट्यूब के रूप में चिह्नित करने के लिए 5 fs1 स्टॉक समाधान की μL स्थानांतरण. प्रत्येक ट्यूब, DDH 2 हे 38.5 μL और फिर 10 के 5 की μL × टी -4 polynucleotide (पी एन) kinase प्रतिक्रिया बफर जोड़ने (MBI Fermentas), जो 500 मिमी Tris एचसीएल (7.6 पीएच, 25 डिग्री सेल्सियस) शामिल 100 मिमी 2 MgCl, 50 मिमी, डीटीटी, 1.0 मिमी spermidine. Pipetting (समाधान विंदुक ऊपर और नीचे कुछ समय के) के द्वारा प्रत्येक समाधान मिश्रण.
  3. एटीपी (100 मिमी, MBI Fermentas) 1 μL जोड़ें और मिश्रण pipetting द्वारा.
  4. (पी टी -4 polynucleotide kinase 0.5 μL जोड़ेंएन.के., 10 इकाइयों / μL, MBI Fermentas) और pipetting द्वारा मिश्रण. 37 ° सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करने की fluorophore photobleaching कम से कम करने के लिए सुनिश्चित करें.
  5. 5 मिनट के लिए 90 ° सेल्सियस हीटिंग द्वारा प्रतिक्रिया बुझाना. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शांत.
  6. 5 EC1 की μL और SS1 स्टॉक 1 ट्यूब और 2 ट्यूब समाधान, क्रमशः जोड़ें.
  7. प्रत्येक ट्यूब मिश्रण, pipetting द्वारा 5 LT1 स्टॉक समाधान की μL जोड़ें. 90 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए ठंडा प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी.
  8. DDH 2 हे 118 μL और फिर 10 में से 20 μL × टी -4 डीएनए ligase (MBI Fermentas) के बफर है, जो 400 Tris - एचसीएल (25 डिग्री सेल्सियस पर 7.8 पीएच) मिमी, 100 मिमी MgCl 2, 100 मिमी डीटीटी, और 5 शामिल जोड़ें मिमी एटीपी. Pipetting द्वारा समाधान मिश्रण.
  9. और pipetting द्वारा मिश्रण, 2 टी -4 डीएनए ligase की μL (MBI Fermentas 5 इकाइयों / μL) जोड़ें. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण को सेते हैं.
  10. प्रत्येक ट्यूब भंवर, 3 एम NaOAc है (7.0 पीएच) के 20 μL जोड़ें और नीचे स्पिन. प्रत्येक ट्यूब ठंड इथेनॉल 100% की 500 μL जोड़ें vortexing द्वारा समाधान मिश्रण और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूबों की जगह.
  11. 11,000 जी पर 20 मिनट के लिए मिश्रण में 4 डिग्री सेल्सियस एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (X22-R, Allegra के Beckman कल्टर) में और के अपकेंद्रित्र ध्यान pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटाने.
  12. डीएनए गोली सूखी एक डीएनए concentrator (सावंत डीएनए Speedvac, थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग कर 10 मिनट के लिए.
  13. 1 के 30 μL × जेल लोड हो रहा है बफर (GLB), संक्षिप्त भंवर में resuspend डीएनए छर्रों और एक benchtop अपकेंद्रित्र है (Minicentrifuge, VWR वैज्ञानिक) के साथ नीचे स्पिन. ligated डीएनए नमूने एक 10% dPAGE के जेल पर लोड करने के लिए तैयार हैं.

3. 10% dPAGE जेल की तैयारी

निम्नलिखित चरणों का संक्षिप्त जेल वैद्युतकणसंचलन और सेट अप के उपकरण का वर्णन. तंत्र सेटिंग्स, और हैंडलिंग के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया देखें टीहमारे पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल ओ 30,31.

  1. धो और सूखी दो गिलास प्लेट, दो .75 मिमी spacers के और एक 16 अच्छी तरह कंघी. क्लिप के साथ गिलास प्लेट और spacers को इकट्ठा करने और नोकदार गिलास प्लेट का सामना करना पड़ के साथ एक फ्लैट सतह पर क्षैतिज रखना.
  2. एक 150 एमएल बीकर में 10% dPAGE के मिश्रण के 40 एमएल स्थानांतरण. जोड़ें एक pipettor साथ घूमता से, 10% के ए पी एस के 400 μL और मिश्रण, tetramethylethylenediamine की 40 μL (Bioshop कनाडा TEMED).
  3. मिश्रण ध्यान से प्लेटों के बीच और डालो तुरंत कंघी सम्मिलित. 10 से 20 मिनट के लिए मिश्रण भाजन करना करने की अनुमति दें. Polymerization अवशिष्ट जेल बीकर में छोड़ दिया मिश्रण की जाँच से पुष्टि की जा सकती है.
  4. एक बार polymerized, कंघी धीरे हटाने और DDH 2 हे के साथ कुओं कुल्ला कुओं में अवशिष्ट जेल समाधान निकालने के.
  5. बाहर का सामना करना पड़ unnotched आयताकार थाली के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र पर प्लेट माउंट और नोकदार की थाली के पीछे एक धातु की थाली जगह है. धातु pl का उपयोगखाया करने overheating है जो गिलास प्लेट दरार कर सकते हैं रोकने में मदद करता है.
  6. तंत्र के ऊपरी और निचले कक्ष में 1 × tbe जोड़ें. जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कुओं बफर से भर रहे हैं और जेल के निचले छोर बफर में डूब जाता है.
  7. 40 (या 750 वी) मा वर्तमान और पूर्व 10 से 15 मिनट के लिए चलाने के लागू होते हैं.

4. Ligated RFD EC1 और RFSS1 के 10% dPAGE के जेल द्वारा शुद्धि

  1. 3.7 कदम के बाद, 1 × tbe एक सिरिंज और एक सुई का उपयोग कर के साथ कुओं कुल्ला.
  2. 2 हर एक के लिए कुओं pipettor और में जेल लोड हो रहा है युक्तियाँ (Diamed) का उपयोग कर में RFD-EC1 और RFSS1 के बंधाव मिश्रण (2.13) से लोड करें. 40 (750 वी) नीचे डाई जब तक वर्तमान मा लागू करें (bromophenol नीला) लगभग 5 सेमी प्लेटों के नीचे बढ़त के ऊपर है.
  3. जेल चल रहा है तंत्र से गिलास प्लेट निकालें, एक फ्लैट बेंच शीर्ष पर नीचे झूठ और ध्यान हटाने के spacers के.
  4. ध्यान से जेल से शीर्ष गिलास प्लेट को हटाने औरप्लास्टिक की चादर के साथ जेल झुर्रियाँ और जेल पर wraps के तह से बचने की कोशिश लपेटो.
  5. ligated उत्पादों या तो कल्पना कर सकते हैं यूवी ग्रहण (260 एनएम) या (360 एनएम) transillumination, जो EC1 या SS1 (EC1 या SS1 की 100 pmol कुछ सेंटीमीटर ऊपर दिखाई डीएनए बैंड उत्पादन होगा एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और 4.2 के कदम में एक अच्छी तरह से में लोड). मार्क एक मार्कर के साथ वांछित डीएनए बैंड.
  6. आबकारी बाँझ रेज़र ब्लेड के साथ डीएनए बैंड, एक ताजा 1.5 एमएल microcentrifuge के ट्यूब में छोटे टुकड़े और हस्तांतरण में जेल में कटौती.
  7. Microcentrifuge ट्यूब के भीतर जेल टुकड़े एक बाँझ विंदुक टिप (200 μL टिप आकार) का उपयोग किया.
  8. प्रत्येक ट्यूब 500 μL डीएनए क्षालन बफर जोड़ें और उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करने के लिए प्रकाश से fluorophores की रक्षा. 10 मिनट के लिए नमूने भंवर.
  9. 11,000 जी पर नमूने 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (Allegra X22-R, Beckman कल्टर) में अपकेंद्रित्र और ध्यान से एस के 350 μL हस्तांतरणupernatant एक ताजा 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब (अगर जरूरत है, एक और 10 मिनट के लिए एक दूसरे क्षालन ताजा क्षालन बफर की 350 μL के साथ किया जा सकता है).
  10. प्रत्येक ट्यूब एम 3 सोडियम एसीटेट (NaOAc, पीएच 7.0) के 35 μL जोड़ें (नमूना मात्रा 0.1 ×), द्वारा मिश्रण vortexing और नीचे स्पिन. प्रत्येक ट्यूब ठंड इथेनॉल 100% की 900 उल जोड़ें. प्रत्येक नमूना मिश्रण एक कुछ सेकंड के लिए ट्यूब हाथ मिलाते हुए. -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए ट्यूबों का रखें.
  11. 11,000 जी पर नमूने में 20 मिनट 4 ° एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में सी के लिए और के अपकेंद्रित्र ध्यान pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटाने.
  12. ठंड इथेनॉल 70% की 100 μL जोड़ें और इसका इस्तेमाल करने के लिए धीरे ट्यूब की पूरी भीतरी दीवार कुल्ला. 4 में 7 मिनट के लिए 11,000 जी पर पुन - अपकेंद्रित्र ° सी. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 10 मिनट के लिए डीएनए concentrator का उपयोग कर गोली सूखी.
  13. DDH 2 हे और भंवर 100 μL में डीएनए छर्रों भंग. डीएनए 260 एनएम यूवी absorbance के आधार पर एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. -20 में दुकान के नमूने° सी का उपयोग करें जब तक.

5. जीवाणुओं की तैयारी

  1. लक्ष्य बैक्टीरियल तनाव ई. K12 (MG1655) और प्रासंगिक नियंत्रण उपभेदों कोलाई सबसे पहले ग्लिसरॉल शेयरों से लेग अगर प्लेट पर चढ़ाया. के तहत एक लौ या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर, एक बाँझ विंदुक टिप और थाली की सतह पर धीरे लकीर लिए लेग अगर हानिकारक से बचने के साथ जीवाणु ग्लिसरॉल स्टॉक छुओ.
  2. रेखादार प्लेटें और 14 ज के लिए सेते हैं 37 ° C पर पलटना. ऊष्मायन के बाद, Parafilm (Pechiney प्लास्टिक पैकेजिंग) और दुकान के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों के पूरे परिधि सील इन प्लेटों 4 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए भंडारित किया जा सकता है.

6. क्रूड कोशिकी मिश्रण की तैयारी (CEMS)

  1. बाँझ 14 एमएल संस्कृति (बी फाल्कन) ट्यूबों एक विंदुक बंदूक है (Corning है) का उपयोग कर में लेग की 2 एमएल बांटना.
  2. एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करना है, अगर 5.2 के कदम में तैयार की थाली में से एक भी कॉलोनी लेने और एसी में डालेंulture ट्यूब. एक मशीन (नई ब्राउनश्विक वैज्ञानिक) में जगह ट्यूब 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट है, और 14 घंटे के लिए 250 rpm पर हिला.
  3. % 1 फिर से टीका संस्कृति: 14 एमएल संस्कृति ट्यूबों और कील में जीवाणु 6.2 चरण में तैयार संस्कृतियों के 20 μL साथ है ताजा लेग के 2 एमएल बांटना. 37 ° C पर 250 rpm पर मिलाते हुए जब तक प्रत्येक जीवाणु समाधान एक 600 के लगभग 1 (ऑप्टिकल घनत्व 600 एनएम पर मापा) आयुध डिपो तक पहुँचता है के साथ ट्यूबों सेते हैं. 600 आयुध डिपो को मापने के लिए, एक डिस्पोजेबल और एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (Genesys 10 यूवी, थर्मो वैज्ञानिक) के साथ 600 एनएम उपाय absorbance के क्युवेट प्रत्येक संस्कृति के 1 एमएल हस्तांतरण.
  4. एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और गोली कोशिकाओं 11,000 जी पर centrifugation द्वारा कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्रत्येक संस्कृति के 1 एमएल स्थानांतरण.
  5. एक ताजा 1.5 एमएल microcentrifuge और -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब की दुकान करने के लिए स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं.

7. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर उपयोग कर पता लगाने

  1. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मुड़ें (Cary ग्रहण, Varian इंक) और 488 एनएम और 520 एनएम के उत्सर्जन में उत्तेजना के साथ डाटा अधिग्रहण मानकों सेट. रीडिंग 1 ज के लिए हर मिनट रखा जा सकता है.
  2. DDH 2 हे, 100% इथेनॉल के साथ 3 क्वार्ट्ज क्रिस्टल के cuvettes (Varian Cary) धो लें. नाइट्रोजन गैस चमकता द्वारा cuvettes सूखी. लेबल cuvettes (1 नियंत्रण) C1, C2 (2 नियंत्रण) और टी (परीक्षण).
  3. C1 और C2 और टी. प्रत्येक क्युवेट और उन प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में जगह के लिए 2 के 25 μL × आरबी जोड़ें CEM - चुनाव आयोग की 24 μL DDH 2 हे के 24 μL स्थानांतरण. पहले 5 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति डेटा इकट्ठा शुरू करो.
  4. C2 और RFD-EC1 1 μL टी और C1 (एक 5 माइक्रोन शेयर के समाधान से) (एक 5 माइक्रोन शेयर के समाधान से) 1 RFSS1 की μL जोड़ें. Pipetting द्वारा प्रत्येक समाधान मिश्रण. यह सावधानी से शुरू किया जाना चाहिए ताकि प्रतिदीप्ति रीडिंग बाधित नहीं कर रहे हैं. 1 घंटे अधिग्रहण के समय के बाकी के लिए जारी रखने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें.
  5. बचानाExcel फ़ाइल स्वरूप में डेटा, एक व्यक्तिगत कंप्यूटर और प्रक्रिया डेटा के लिए एक ग्राफिकल छवि बनाने के लिए डेटा स्थानांतरण.

8. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा जांच

एक ही प्रतिक्रिया 7.4 चरण में तैयार मिश्रण जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वैकल्पिक रूप से नई प्रतिक्रियाओं इसी तरह तैयार किया जा सकता है और 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में incubated. या तो मामले में:

  1. 3 से एम NaOAc और 100% इथेनॉल 125 μL 5 μL जोड़कर बुझाना प्रतिक्रियाओं (1 घंटे के बाद). Vortexing द्वारा प्रत्येक समाधान मिश्रण और -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 1 घंटे के लिए ट्यूबों की जगह.
  2. 11,000 जी पर प्रतिक्रिया मिश्रण 4 बजे 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ° सी और ध्यान से pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटाने.
  3. 10 मिनट के लिए डीएनए concentrator का उपयोग छर्रों सूखी.
  4. 1 के 20 μL में है resuspend छर्रों × संक्षिप्त vortexing द्वारा GLB. एक benchtop अपकेंद्रित्र है (Minicentrifuge, VWR वैज्ञानिक) के साथ नीचे ट्यूबों स्पिन बहुत संक्षेप में. इन नमूनों को पढ़ रहे हैंएक dPAGE जेल में लोड करने के लिए y.
  5. एक 10% dPAGE जेल के रूप में 3.1-3.7 में वर्णित तैयार. प्रतिक्रिया नमूने (8.4 कदम से) लोड कुओं एक pipettor और में जेल लोड हो रहा है युक्तियाँ (Diamed) का उपयोग में. 40 (750 वी) नीचे डाई जब तक वर्तमान मा लागू करें (bromophenol नीला) लगभग 5 सेमी प्लेटों के नीचे बढ़त के ऊपर है.
  6. गिलास प्लेट निकालें और नल का पानी के साथ अच्छी तरह से धोने के लिए किसी भी जेल टुकड़े को दूर. एक kimwipe (प्रोफेशनल Kimberly-क्लार्क) के साथ प्लेट साफ कर लें.
  7. आंधी स्कैनर (9200 आंधी, चर मोड, जीई हेल्थकेयर) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति के लिए जेल प्लेट स्कैन करें. ImageQuant सॉफ्टवेयर (आण्विक डायनेमिक्स) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण.

9. डिटेक्शन विशिष्टता

  1. बैक्टीरियल विशिष्टता के परीक्षण के लिए, उसी प्रक्रिया संवर्धन ई. के लिए ऊपर वर्णित कोलाई, CEM तैयारी और एक दरार प्रतिक्रिया परख आयोजित बी जैसे विभिन्न जीवाणु उपभेदों के एक नंबर के लिए किया जा सकता है subtilis, पी. Peli, वाई ruckeri, एल पीlanturum, पी. acidilactici (चित्र. 3A में दिखाया गया है).

10. एकल कोशिका का पता लगाने

एक 1 एमएल ई है तैयार कोलाई 2 CFU / एमएल (CFU इकाई के गठन कॉलोनी) ग्लिसरॉल शेयर धारावाहिक कमजोर पड़ने से चढ़ाना द्वारा CFU एकाग्रता की पुष्टि 5 इस शेयर 0.2 CFU/100 μL शामिल करना चाहिए. -80 में स्टोर ° सी का उपयोग करें जब तक.

  1. 10 संस्कृति लेग के 2 एमएल युक्त ट्यूब तैयार.
  2. 2 ग्लिसरॉल CFU / एमएल स्टॉक और सेते हैं के 100 μL के साथ 37 ° C 250 rpm पर मिलाते हुए प्रत्येक संस्कृति के साथ टीका लगाना. पूरे ग्लिसरॉल स्टॉक (1 एमएल) का उपयोग 10 संस्कृतियों उपज चाहिए.
  3. 4, 8, 12, 16 और 24 घंटे: फसल काटने वाले निम्न समय बिंदुओं पर 300 प्रत्येक टीका संस्कृति ट्यूब से μL. शेष संस्कृति छोड़ दो 24 घंटे के लिए विकसित करने के लिए.
  4. 600 आयुध डिपो मापने के लिए और 5 मिनट के लिए 11,000 जी पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं वेग.
  5. ताजा 1.5 एमएल microcentrifuge -20 और घ में ट्यूब की दुकान करने के लिए CEMS स्थानांतरणजैसे, सी का उपयोग करें जब तक.
    नोट: के बाद से वहाँ कोई detectable 600 आयुध डिपो 4 अंक, 8 और 12 के समय में काटा नमूनों के लिए हो सकता है, तो शेष संस्कृति 24 घंटे के लिए विकसित करने के क्रम में बैक्टीरिया (मैलापन और आयुध डिपो माप द्वारा निर्धारित) युक्त संस्कृतियों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं. केवल एक या दो 10 संस्कृतियों के ई. शामिल कर सकते हैं टीका के बाद कोली और शेष ट्यूबों कोई कोशिकाओं को नहीं शामिल होंगे.
  6. RFD-EC1 साथ दरार प्रतिक्रियाओं तैयार नामित timepoints (° सी -20 में संग्रहीत) पर सकारात्मक संस्कृतियों से बरामद CEMS का प्रयोग करें, और तब प्रतिक्रिया dPAGE जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर धारा 8 में वर्णित के रूप में मिश्रण का विश्लेषण.

11. संकल्पना और प्रतिनिधि परिणाम

एक शाही सेना cleaving बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट DNAzyme (RFD) के शोषण की अवधारणा चित्र में सचित्र है. 1. RFD एक chimeric डीएनए के / एक अकेला शाही सेना उठाना (नीला आर) में शाही सेना सब्सट्रेट दो लेबल nucleotides द्वारा flanked cleaves(एफ) की fluorophore और (क्यू) पेय, क्रमशः के साथ. ब्याज की एक जीवाणु (जैसे ई. कोलाई) के रूप में मीडिया में बढ़ता है, यह एक कच्चे कोशिकी मिश्रण (यूके) के पीछे छोड़ देंगे. इस CEM के एक पूरे के रूप में तो इन विट्रो चयन प्रयोग में है में इस्तेमाल के लिए एक RFD कि उत्तरदायी है CEM के लिए विशेष रूप से प्राप्त, संभाव्यतः RFD है CEM है कि जीवाणु के एक हस्ताक्षर अणु में एक विशिष्ट अणु (बैंगनी स्टार) के साथ सूचना का आदान प्रदान. जब CEM प्रतिक्रिया RFD युक्त समाधान के लिए जोड़ा जाता है, यह आरएनए cleaving RFD की गतिविधि चलाता है. दरार घटना क्यू से अलग एफ, एक फ्लोरोसेंट संकेत है कि या तो पता लगाया जा सकता है या जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा fluorimeter का उपयोग में जिसके परिणामस्वरूप.

इसके बाद के संस्करण की अवधारणा के प्रयोगात्मक सत्यापन ई. से CEM के साथ किया गया था कोली (यूके ईसी). हम इन विट्रो चयन के माध्यम से 3 RFD अणुओं, प्राप्त और सबसे कुशल एक RFD EC1 (2A छवि) के रूप में नामित किया गया था 5 डब्ल्यू.ई CEM - चुनाव आयोग के जवाब में दरार RFD-EC1 की गतिविधि (एक उत्परिवर्ती RFSS1 नाम अनुक्रम के साथ साथ) का परीक्षण किया. RFD-EC1 दोनों और RFSS1 DNAzyme भाग के enzymatic fs1 सब्सट्रेट (सभी दृश्यों में छवि में दिखाया गया 2A कर रहे हैं.) Ligation द्वारा तैयार किए गए. प्रतिदीप्ति माप प्रयोग (छवि 2B) में, CEM - ईसी अकेले को 5 मिनट, RFD-EC1 या RFSS1 के अलावा, के लिए और अधिक 55 मिनट के लिए आगे ऊष्मायन द्वारा incubated किया गया था. समाधान की प्रतिदीप्ति तीव्रता लगातार हर मिनट में पढ़ा था और डेटा के सापेक्ष प्रतिदीप्ति की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (आरएफ, समय टी में प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात बनाम 0 समय प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में गणना). ऊष्मायन की समय बनाम आरएफ मान चित्र के रूप में प्लॉट किए जाते हैं. 2B. यह पाया गया कि RFD-EC1 यूके - चुनाव आयोग के अलावा पर प्रतिदीप्ति संकेत के एक उच्च स्तर का उत्पादन किया, के विपरीत में, RFSS1 एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत उत्पादन नहीं किया था. इस प्रकार, प्रतिदीप्ति उत्पादन फू केRFD-EC1 यूके - चुनाव आयोग से संपर्क करने पर nction अनुक्रम विशिष्ट है.

सत्यापित करने के लिए कि मनाया प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है शाही सेना से उठाना की दरार की वजह से हैं, हम dPAGE द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण का विश्लेषण किया. RFD-EC1 की दरार दो डीएनए टुकड़े, एक 5 की fluorophore को बनाए रखना है और एक 3 टुकड़ा टुकड़ा पेय को बनाए रखना उत्पन्न होने की उम्मीद है. केवल RFD EC1 (unclv) uncleaved और 5 'टुकड़ा (CLV) के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के द्वारा पता लगाया जा सकता है. dPAGE परिणाम चित्र में दिखाया गया है. 2C से पता चलता है कि RFD-EC1 और CEM - ईसी की प्रतिक्रिया मिश्रण वास्तव में उम्मीद दरार उत्पाद का उत्पादन किया, जबकि RFSS1/CEM-EC मिश्रण नहीं किया.

RFD-EC1 की विशिष्टता कई अन्य ग्राम नकारात्मक और सकारात्मक ग्राम बैक्टीरिया से एकत्र और डेटा छवि में दिखाया गया है CEMS का उपयोग कर जांच की गई थी. 3A. केवल CEM चुनाव आयोग (नीला वक्र) युक्त नमूना प्रतिदीप्ति में वृद्धि का उत्पादन. CEMS साथ पार जेट की कमीअन्य जीवाणुओं से इंगित करता है कि RFD-EC1 ई. के लिए अत्यधिक चयनात्मक है कोलाई.

हम भी एकल ई. संवर्धन के लिए आवश्यक समय की जांच आदेश में करने के लिए पर्याप्त CEM कि RFD-EC1 की दरार पैदा कर सकते हैं उत्पादन कोली सेल. इस प्रयोग, ई. के लिए कोलाई नमूना CFU परिभाषित (इकाइयों कॉलोनी के गठन) युक्त पर्याप्त रूप से के 1 CFU / एमएल की एकाग्रता को प्राप्त करने के पतला किया गया था. यह विकास मीडिया और यह संवर्धन के साथ 4, 8, 12, 16, और 24 घंटे के लिए पतला बैक्टीरिया के नमूने के 100 μL मिश्रण द्वारा पीछा किया गया था. CEMS तो प्रत्येक timepoint के लिए एकत्र किए गए थे और RFD EC1 की दरार गतिविधि के उत्प्रेरण के लिए परीक्षण किया गया. dPAGE परिणाम चित्र में दिखाया गया है. 3B इंगित करता है कि 12 ज के संवर्धन समय की जरूरत है.

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि प्रारंभिक छोटे संकेत वृद्धि CEM - चुनाव आयोग RFSS1 अनुक्रम (एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) के बाद इसके अलावा प्रतिदीप्ति माप में मनाया (छवि 2B, लाल curvई) या अन्य जीवाणु CEMS (3B छवि, RFD-EC1, नीले रंग को छोड़कर सभी घटता) FRQ मॉड्यूल के आंतरिक प्रतिदीप्ति (क्यू द्वारा एफ का अधूरा शमन के कारण) को जिम्मेदार ठहराया है. इस प्रकार, यह उम्मीद है कि एफ क्यू लेबल दृश्यों के अलावा एक प्रारंभिक प्रतिदीप्ति वृद्धि का उत्पादन होगा. हालांकि, केवल RFD-EC1/CEM-EC मिश्रण समय पर प्रतिदीप्ति के एक उच्च स्तर का उत्पादन करने में सक्षम हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 आरएनए cleaving फ्लोरोसेंट DNAzyme जांच (RFD) की योजनाबद्ध चित्रण कि कच्चे कोशिकी (यूके) मिश्रण हित के विशिष्ट बैक्टीरियल कोशिकाओं द्वारा उत्पादित के साथ संपर्क पर fluoresces. RFD एक chimeric डीएनए के / एक अकेला शाही सेना उठाना (नीला आर) में शाही सेना सब्सट्रेट दो (एफ) की fluorophore और पेय (क्यू), क्रमशः के साथ लेबल nucleotides द्वारा flanked cleaves. दरार प्रतिक्रिया से पहले, RFD की प्रतिदीप्ति स्तर कम है करीब प्रोक्स के कारणएफ और अतारांकित की दरार पर imity, क्यू एफ से रवाना, एक परिणाम के रूप में, एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत उत्पादन किया है.

चित्रा 2
चित्रा 2 ई.. RFD कोलाई संवेदन. (ए) RFD-EC1 DNAzyme जांच है कि CEM - चुनाव आयोग द्वारा सक्रिय किया जा सकता है. RFSS1 RFD-EC1 के तले अनुक्रम एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया है. RFD-EC1 और RFSS1 के EC1 और SS1 के साथ ligating fs1, क्रमशः टेम्पलेट के रूप में LT1 की उपस्थिति में, द्वारा उत्पादित थे. एफ: fluorescein - बार संशोधित deoxythymidine. प्रश्न: Dabcyl - बार संशोधित deoxythymidine. Adenine ribonucleotide: आर. (बी) प्रतिदीप्ति CEM चुनाव आयोग की उपस्थिति में RFD-EC1 और RFSS1 के प्रोफाइल के संकेत. (सी) बी में दरार प्रतिक्रिया मिश्रण की dPAGE विश्लेषण (प्रतिक्रिया समय: 60 मिनट). चित्र dPAGE साथ आंधी स्कैनर द्वारा प्राप्त जेल के एक प्रतिदीप्ति छवि है. लेन नेकां: RFD-EC1 या अकेले प्रतिक्रिया बफर में RFSS1, CEM - ईसी लेन: RFD-EC1 या प्रतिक्रिया CEM - ईसी युक्त बफर में RFSS1. मार्करRFD CE1 0.25 एन NaOH, एक शाही सेना के पूर्ण दरार के कारण जाना जाता प्रक्रिया के साथ इलाज किया. unclv: uncleaved RFD-EC1. CLV: दरार की fluorophore युक्त टुकड़ा.

चित्रा 3
चित्रा 3 (ए) प्रतिदीप्ति विभिन्न बैक्टीरियल कोशिकाओं से तैयार अंग्रेजी RFD-EC1 का प्रोफ़ाइल संकेत है. चुनाव आयोग: कोलाई-K12 Escherichia, पीपी: स्यूडोमोनास Peli, बी.डी.: Brevundimonas के diminuta; हा: alvei Hafnia, वाई आर Yersinia ruckeri, ओग: Ochrobactrum grignonese, कुल्हाड़ी: Achromobacter xylosoxidans, एमओ: Moraxella osloensis,Acinetobacter lwoffi है, एस एफ: Serratia fonticola, बी एस: दण्डाणु subtilis, एल एम: Leuconostoc mesenteroides, एल.पी.: लैक्टोबैसिलस planturum, फिलीस्तीनी अथॉरिटी: Pediococcus acidilactici, ए ओ एक्टिनोमाइसेस orientalis. प्रत्येक CEM नमूना को 5 RFD-EC1 के अलावा के बाद मिनट के लिए incubated किया गया था. (बी) dPAGERFD-EC1/CEM-EC मिश्रण की एक प्रतिक्रिया 60 मिनट के बाद विश्लेषण. लेन NC1: RFD-EC1 प्रतिक्रिया बफर अकेले में. लेन NC2: RFD-EC1 प्रतिक्रिया CEM बी एस (दण्डाणु subtilis से तैयार यूके) युक्त बफर में. गलियों प्रतिक्रिया CEM - ईसी युक्त बफर जीवाणु एक एकल ई. युक्त संस्कृति से लिया RFD-EC1: 4, 8, 12 16, और 24 के साथ लेबल कोली सेल 4 के एक बढ़ती अवधि के बाद, 8, 12, 16 और 24 घंटे, क्रमशः.

Discussion

आम जीवाणु तरीकों का पता लगाने के अधिकांश आज भी (क्लासिक सूक्ष्म) धीमी गति से या तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं (एंटीबॉडी, पीसीआर). इस प्रकार, हमें विश्वास है कि उपकरणों का पता लगाने की अगली पीढ़ी की गति और सादगी की ओर पूरा करना चाहिए. यह अंत करने के लिए, हम एक शाही सेना cleaving और प्रतिदीप्ति संकेत DNAzyme कि सरल assays के विकास के लिए एक प्रतिदीप्ति संकेत की पीढ़ी के माध्यम से बैक्टीरिया की उपस्थिति की रिपोर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बनाया है. विशेष रुप से प्रदर्शित DNAzyme जांच, RFD-EC1, ई. के विकास के दौरान उत्पादित CEM के द्वारा सक्रिय है संस्कृति मीडिया में कोलाई. जीवाणु का पता लगाने के लिए assays के प्रकार के बाद से हमारे विधि का पता लगाने के लक्ष्य के रूप में एक जीवाणु के कच्चे कोशिकी मिश्रण का उपयोग करता है और श्रमसाध्य लक्ष्य निष्कर्षण और प्रवर्धन कदम नजरअंदाज करते हैं, यह बहुत सरल सेट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है "मिश्रण और पढ़ें". हमारे DNAzyme का उपयोग प्रतिदीप्ति आधारित विधि का पता लगाने के लिए ही सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, वर्णमिति पता लगाने के एक ही DNAzyme प्रणाली परख सी का उपयोगएक विधि पहले की रिपोर्ट है कि एक कार्बनिक डाई के साथ संयोजन के रूप में रोलिंग चक्र प्रवर्धन कारनामे का उपयोग कर बनाया 32. हम बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक आकर्षक अवसर के रूप में DNAzymes का उपयोग अधिक से अधिक परिचालन सादगी के साथ नया बैक्टीरियल biosensors उत्पन्न की उम्मीद है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा (NSERC) और प्रहरी bioactive कागज नेटवर्क के द्वारा इस कार्य के लिए अनुदान प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada AGR003
Ammonium persulfate (APS) BioShop Canada AMP001
Acrylamide/Bis-acrylamide (40%, 29:1) BioShop Canada ACR004
Boric acid BioShop Canada BOR001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Electron Microscopy Sciences EXO539-1
HCl Sigma-Aldrich 38281
HEPES BioShop Canada HEP001
LB broth Sigma-Aldrich L3022
MgCl2 EMD Millipore B10149-34
NaCl BioShop Canada SOD002
NaOAc EMD Millipore SXO255-1
NaOH EMD Millipore SXO590-1
SDS BioShop Canada SDS001
TEMED BioShop Canada TEM001
Tris-base BioShop Canada BST666
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Urea BioShop Canada URE001
Xylenecyanol FF Sigma-Aldrich X4126
DNA concentrator Thermo Fisher Scientific, Inc. Savant DNA SpeedVac 120
Millex filter unit EMD Millipore SLGP033RS
Gel loading tips Diamed TEC200EX-K
ImageQuant software Molecular Dynamics Version 5.0
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 34705
Mini Vortexer VWR international 58816-121
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM996
Petri dishes Fisher Scientific Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (Pipette gun) Corning 07764714
Quartz cuvettes Varian Inc., Agilent 66-100216-00
Shaker/Incubator New Brunswick Scientific Classic Series C24
Typhoon Scanner GE Healthcare 9200 Variable mode
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X22-R
UV Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc. GenesysUV 10
Fluorescence Spectrophotometer Varian Inc., Agilent Cary Eclipse

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References

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Fluorogenic DNAzymes का प्रयोग जीवाणु की जांच
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Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).More

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).

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