Summary
We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.
Abstract
We zijn het beschrijven van een snelle methode om zich te distantiëren en cultuur hippocampus of corticale neuronen van E15-17 rat embryo's. De procedure kan met succes worden toegepast voor de isolatie van muizen en menselijke primaire neuronen en neurale progenitoren. Los neuronen worden bijgehouden in serum-vrij medium tot enkele weken. Deze culturen gebruikt worden voor nucleofectie, immunocytochemie, nucleïnezuren bereiding en elektrofysiologie. Oudere neuronale kweken ook worden getransfecteerd met een goede rendement van lentivirale transductie en minder efficiënt, met calciumfosfaat of lipide-gebaseerde methoden zoals lipofectamine.
Protocol
1. Poly-D-Lysine (PDL): Voorbereiding
- Voeg 5 ml steriele DDH 2 O tot 5 mg van het PDL om een voorraad oplossing van 1 mg / ml te verkrijgen.
- Meng voorraadoplossing door pipetteren meerdere malen.
- Onmiddellijk gebruiken of op te slaan Poly-D-Lysine oplossing bij 2-8 ° C.
2. Poly-D-Lysine (PDL): Coating Plastic Cel Cultuur Dishes
- Verdun de PDL voorraadoplossing met steriel DDH 2 O de uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml.
- Pipetteer genoeg oplossing in een 60 mm schaal tot cultuur oppervlakte (3 ml voor een 60 mm schotel) te dekken.
- Rock voorzichtig om zelfs coating van de cultuur oppervlak te verkrijgen.
- Incubeer beklede platen bij kamertemperatuur (RT) overnacht.
- De volgende dag, meestal de dag van de dissectie, verwijder de poly-D-Lysine oplossing door aspiratie en was korte tijd met 3 ml steriele DDH 2 O. Herhaal deze stap. Na de tweede wasbeurt, volledig te verwijderen water door aspiratie.
- Platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C tot drie weken.
3. Poly-D-Lysine (PDL) en laminine: Voorbereiding en coaten van glas zijn twee-kamer-Dia
- Mix PDL (1 mg / ml) en laminine (1 mg / ml) voorraadoplossingen in steriele DDH 2 O de eindconcentratie van 10 en 5 ug / ml.
- Pipetteer voldoende oplossing in putjes van een glas met twee kamers dia de cultuur oppervlak (1 ml voor elke wel van een 2 en glas twee kamers dia) omvat.
- Rock voorzichtig om zelfs coating van de cultuur oppervlak te verkrijgen.
- Incubeer gecoate platen nacht bij kamertemperatuur geroerd.
- De volgende dag, verwijder de Poly-D-Lysine-Laminine coating oplossing via aspiratie en tweemaal kort wassen met 1 ml steriele DDH 2 O. Na de tweede wasbeurt, volledig te verwijderen water door aspiratie.
- Kamer dia's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal drie weken.
Opmerking: Alle glazen kamer dia kan worden bekleed following dit protocol. We maken vaak gebruik van de twee-kamer-dia's, omdat elke dia zorgt voor de controle-test experimentele setting (bijvoorbeeld onbehandeld versus behandeld, ongetransfecteerde versus getransfecteerd).
4. Neuronale Dissection en Cultuur
- Verwarm de volgende reagentia in een 37 ° C waterbad
- TrypLE Express op de oorspronkelijke 100 ml fles.
- Neurobasal/B27 compleet medium (zie tabel I). Opgewarmd Het volume is afhankelijk van het aantal gerechten te zijn verguld (bijv. 30 ml voor tien 60 mm vergulde schotels).
- Voeg 3 ml koud Hibernate E-oplossing met vier 60 mm cultuur gerechten en 13 ml van een 15 ml BD Falcon hoge helderheid polypropyleen conische buis.
- Voeg 25-30 ml koud dissectie medium (zie tabel II, Dr Olimpia Meucci, persoonlijke communicatie) aan elk van de drie 100 mm cultuur gerechten. Deze platen, die een grote hoeveelheid medium, worden gebruikt om de embryo onmiddellijk nadat deverwijdering uit het vruchtwater zakken (stap 4.7 en 4.8).
- Euthanaseren een E17 getimede zwangere ratten door CO 2 in overeenstemming met de GGD-beleid inzake humane zorg en het gebruik van proefdieren en onder een institutioneel goedgekeurd verzorging van dieren en gebruiken protocol.
- Spuit onderbuik met 70% EtOH en snijd mediaal door de huid en de spieren met een schaar het blootstellen van de baarmoeder en embryo's.
- Verwijder alle foetussen en leg ze in een steriele 100-mm schotel met een overmaat aan koude dissectie medium (25-30 ml, zie stap 4.3).
- Snijd embryo's met een kleine schaar van vruchtzak en plaats ze in de tweede 100-mm schaaltje met koud dissectie medium.
- Was de embryo's bij kamertemperatuur door voorzichtig kantelen van de 100-mm schotel voor 5-10 seconden. Dan dragen de gespoelde embryo's naar de derde 100 mm schotel met het ontleden van medium. Twee wasbeurten in overmaat medium zijn meestal voldoende om alle sporen van bloed te verwijderen. Indien negessary, een keer wassen met een verse 100 mm schotel met 25-30 ml koud dissectie medium.
- Met behulp van een stereomicroscoop en gebogen pincet, pak elke rat embryo van de hersenen door het uittrekken van de huid en schedel. Plaats hele brein in een van de 60-mm gerechten (meestal met niet meer dan 5 hersenen per gerecht) met koud Hibernate E. Bewaar deze platen op ijs.
- Neem een gerecht per keer en, onder een stereomicroscoop, scheiden de hemisferen en isoleren van de cerebrale cortex het verwijderen van de middenhersenen en de hersenvliezen.
- Optioneel: cut hersenen langs de middellijn, uitpakken hippocampus, en onder de procedure om hippocampale neuronen te isoleren volgen.
- Verzamel alle ontleed cortex in een 15-ml helder conische buis met daarin 13 ml koud Hibernate E. Laat de cerebrale cortex op ijs totdat alle dissecties zijn voltooid. Door hun kleine afmetingen kan ontleed hippocampus worden verzameld in een 1,5 ml Eppendorf buis in plaats van een 15-ml-buis. Desgewenst bij deze stap cortices ofhippocampus kan in een cryotube flacon 1 ml Hibernate E + 2% B27 + gentamicine (50 ug / ml) + fungizon (250 ng / ml) in een verhouding van 2-4 of 2-4 corticaal hippocampus per flacon. Hersenweefsel kan worden bewaard bij 4 ° C in het donker tot een week (later tijden niet niet getest). Wanneer nodig, gebruik maken van fijne tang om het hersenweefsel over te dragen aan een 15 ml buis met Hibernate E en volg de onderstaande protocol om neuronen te isoleren.
- Breng de buis tot een weefselkweek kap. Laat de cortex om zich te vestigen op de bodem van de buis en dan voorzichtig de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 13 ml verse Hibernate E naar de 15 ml conische buisje, corticaal op de bodem van de buis en verwijder de supernatant. Herhaal deze stap nog 2 keer, en na de laatste wasbeurt, verwijder zorgvuldig alle media.
- Enzymatisch verteren cerebrale cortex door het toevoegen van 1-2 ml (afhankelijk van het aantal cortex, gebruiken minder voor de hippocampus isolatie) van warme TrypLE Express. Sluit de dop van de buis met Parafilm en zweven de buis in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten.
- Spuit de buis met 70% ethanol voor het openen van de kap en voeg 10 ml van Hibernate E. Laat de cortex om zich te vestigen op de bodem van de buis en de supernatant te verwijderen. Herhaal deze stap drie keer uit te spoelen TrypLE Express. In de laatste stap, verwijder zorgvuldig alle media.
- Voorzichtig fijnstampen (4-5 keer) de cortex in 2 ml Neurobasal/B27 volledig medium met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur (ongeveer 1 mm in diameter). Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden.
- Herhaal andere 4-5 keer met een steriele glazen pasteurpipet kleinere diameter (een pipet over 1/2-3/4 mm diameter). Gebruik een pasteurpipet kleiner dan deze of vernietigen van de cellen.
- Laat de resterende stukjes weefsel (over het algemeen zeer weinig of zelfs geen) om zich te vestigen.
- Breng de bovenste single-celsuspensie om een nieuwe 15-ml-buis, met achterlating van vestigde stukjes weefsel. Bontther verwatering van de celsuspensie maximaal 10-12 ml met Neurobasal/B27 volledig medium.
- Mengen en verdund cellen geteld door 10 pi celsuspensie 490 pi 50x tellen oplossing (zie tabel III) in 1,5 ml eppendorfbuisje.
- Plaat cellen PDL-gecoate platen in de dichtheid van 5,0 x 10 4 / cm 2. Als nucleofectie wordt uitgevoerd, raden uitplaten de cellen bij een hogere concentratie (8-10 x 10 4 / cm 2).
- Normaal gesproken hebben we ontleden 9-10 foetussen per experiment, aangezien ongeveer 13 x 10 6 neuronen zijn afgeleid van elke E17 foetus. Als er meer embryo's nodig zijn, ervoor te zorgen dat de hele procedure niet meer dan twee uur duren.
- Desgewenst 24 uur na isolatie kan 10 uM van cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) toegevoegd aan elke schotel, zodat gliacellen verhinderd kan worden. Toch is deze stap niet nodig, aangezien Neurobasal/B27 medium remt gliale proliferatie, Volgens de aanbevelingen van de fabrikant (Invitrogen / Gibco).
- Neuronen kan worden gebruikt voor proeven na 4-5 dagen in vitro, hoewel Dit ligt op de gewenste differentiatiestadium. Wij hebben gekweekte neuronen tot 4 weken zonder een significante afname in overleving (figuur 1).
- Voor uitgebreide kweken, vervang dan het kweken van medium elke week met vers bereide Neurobasal/B27 volledig medium.
5. Representatieve resultaten
Neuronen gekweekt op glazen kamer dia's worden onderworpen aan immunocytochemie. Figuur 1 toont een typisch beeld van een corticale neuron vastgesteld na vijf dagen kweken en immunolabeled met anti-MAP-2 antilichaam neuronale processen vertonen.
Figuur 2 toont een representatief beeld van een rat hippocampal neuron na 3 weken in cultuur. De neuronale morfologie van een volledig gedifferentieerde cel wordt gemarkeerd door MAP-2 immunolabeling (MAP-2 neuronale marker, muis monoklonaal antilichaam kloon AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), na een standaard procedure, zoals eerder beschreven 1. De beelden werden zichtbaar gemaakt met de Nikon Eclipse E400 rechtop fluorescentiemicroscoop uitgerust met EXI aqua camera (Qimaging), gemotoriseerde Z-as, en SlideBook5 aankoop / deconvolutie software (Intelligent Imaging Innovations, Inc, Denver, CO). Een reeks van drie-dimensionale beelden van elk beeld werd deconvoluted een tweedimensionaal beeld en opgelost door aanpassing van de signaal afgesneden tot nabij maximale intensiteit aan oplossing te verhogen.
Figuur 3 toont zuiverheid van neuronale kweken. Eiwit lysaten werden verkregen van DIV7 rat neuronale culturen (CTX) en van een geval van menselijke glioblastoom (GBM). Zoals verwacht, de neuronale lysaat is sterk positief voor de neuronale eiwitten MAP-2 en negatief voor de astrocytaire marker GFAP, terwijl de GBM eiwit lysaat negatief is fof MAP-2 en positief voor GFAP.
Hoewel in ons protocol hebben we gebruik gemaakt van Hibernate E voor enkele jaren als ontleden en spoelen medium, onlangs hebben we verkend van een extra en zeer praktisch gebruik van om hersenweefsel te behouden voor verder gebruik. Figuur 4 illustreert een dag in vitro 5 (DIV5) cultuur van de rat corticale neuronen geïsoleerd van cortex bewaard op 4 ° C gedurende een week in de sluimerstand E + B27 na hun oorspronkelijke dissectie van de embryo's. Neuronen uitgeplaat op een glazen twee kamers dia bekleed met PDL en laminine zoals eerder beschreven. De verworven beeld werd deconvoluted met SlideBook5 verwerving / deconvolutie software zoals hierboven beschreven (figuur 2).
Figuur 1. Representatief beeld van een corticaal neuron nucleofected met pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) en immunolabeled met MAP-2 Antilichaam, in het rood. Originele vergroting 100x.
Figuur 2. Representatief beeld toont MAP-2 immunokleuring, in rood, van de hippocampus neuronen na 3 weken in de cultuur. DAPI vlekken, in de kleuren blauw, toont cellulaire kernen. Originele vergroting 40x.
Figuur 3. Western blot toont zuiverheid van neuronale celkweken. 30 ug rat neuronale en menselijke GBM eiwit lysaten werden gescheiden door elektroforese en onderworpen aan Western blot analyse volgens standaard procedures 1. Anti-MAP-2 was een konijn polyklonaal van Cell Signaling (Danvers, MA), anti-GFAP antilichaam was een muize-monoclonaal van Chemicon (Millipore, Billerica, MA) en muizen monoclonale anti-GRB2-antilichaam van BD Transduction Laboratories ( Sparks, MD). GRB2 werd gebruikt als een laad controle. 
Figuur 4. Representatieve beelden dagen in vitro 5 (DIV5) rat corticale neuronen verkregen corticaal links in de slaapstand E + B27 bij 4 ° C gedurende een week na de dissectie. A) fase contrast van neuronen gekweekt op een glazen twee kamers schuif. Originele vergroting 20X. B) Immunofluorescentie die expressie van MAP-2 in neuronale processen, in het groen, de cultuur was negatief voor de astrocytaire marker GFAP. DAPI vlekken, in de kleuren blauw, geeft aan cellulaire kernen. Originele vergroting 40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De werkwijze van ontleding en cultuur rat hippocampale en corticale neuronen beschreven kan uitvoeren experimenten met nagenoeg zuiver neuronale kweken gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium (figuur 3). Hoewel protocollen voor het kweken van nagenoeg zuivere neuronen in serum-vrij medium zijn eerder beschreven 2,3,4 er belangrijke wijzigingen in onze methode. Anders dan de traditionele protocollen (dat wil zeggen Banker et al..) 5, hebben we vervangen door trypsine met TrypLE Express, een zachtere dissociatie enzym. We hebben ook weggelaten twee stappen die invloed kunnen hebben op de integriteit van neuronale cellen: hakken van de cortex of hippocampus voorafgaand aan de enzymatische spijsvertering en het gebruik van DNase. Ook dissectie van embryo's in de sluimerstand E (stap 4.2) geholpen om levensvatbare en gezonde cellen te behouden. Hibernate E is een voedingsbodem gebruikt voor onderhoud van neurale weefsels of cellen omgevingstemperatuur kooldioxidegehalte (Invitrogen, Life Technologies, Grand Islen, NY). Oorspronkelijk geformuleerd voor de verzending van afgelegen gebieden van de hersenen (hippocampus, striatum en cortex), kunnen overwinteren E medium gebruikt worden om de hersenen levensvatbaar te houden tijdens de isolatie van zenuwweefsel of om neuronen gezond te houden tijdens de microscopie, elektrofysiologie of flowcytometrie. Inderdaad, Figuur 4 toont een representatief beeld rat corticale neuronen gekweekt gedurende 5 dagen op glas twee kamers glijbanen. Voorafgaand aan de verwerking ervan, cortex werden bewaard bij 4 ° C in de sluimerstand E + B27 in het donker voor een week na hun dissectie van de E17 embryo's. Interessant neuronen geïsoleerd uit weefsel op 4 ° C gedurende een aantal dagen waren morfologisch vergelijkbaar zijn met die werden geïsoleerd op dezelfde dag als de embryo dissectie. Met de mogelijkheid om het isoleren van de neuronen op verschillende tijdstippen na de sectie van de embryo's kunnen zeer nuttig zijn bij het plannen van experimenten en dus in het maken van een volledig gebruik van de tijd-zwangere dier.
Er wordt mentioned dat ons protocol efficiënt werkt op embryo's van E13 tot E17, maar het is nooit getest op pasgeboren baby of een volwassen knaagdieren. Het werkte ook heel goed voor de isolatie en de cultuur van de menselijke foetale neuronen (ongepubliceerde gegevens).
Cellen geïsoleerd met de methode hier beschreven worden uitgeplaat in weefselkweekschalen voor experimenten waarvoor oogsten een groot aantal cellen voor RNA / DNA of eiwit-extractie. Voorbeelden omvatten behandeling van neuronen enkele verbindingen of peptiden, zoals in het werk op HIV-eiwit Tat 1. Groeifactor-gemedieerde signaalwegen kan ook worden onderzocht of RNA kan worden gezuiverd voor genexpressie of miRNA profilering arrays 6.
Daarnaast nucleofectie van de neuronen voor het uitplaten is een hulpmiddel om moleculen of groei-omstandigheden die neuronale differentiatie 1 op te onderzoeken. Andere toepassingen zijn transfectie van gedifferentieerde neuronen door Lipofectamine 2000 (InvitrOgen, Carlsbad, CA) 1. Hoewel de doelmatigheid van transfectie zeer laag in vergelijking met nucleofectie is geschikt voor zeer gevoelige assays zoals luciferase reporter-assay of elektrofysiologie onderzoeken. Bovendien kan neuronen gekweekt op de glazen kamer dia worden onderworpen aan immunocytochemie (figuren 1 en 4B) 1. Tot slot hebben we met succes volgde dit protocol om neurale voorlopercellen uit muizenembryo's 7 los te koppelen, met een wijziging in de laatste stap in die geïsoleerde neurale voorlopercellen worden gekweekt in een bepaald medium, zoals eerder beschreven 7,8. Over het geheel genomen deze eenvoudige methode heeft een verscheidenheid aan toepassingen en gemakkelijk biedt neuronen voor studies die geen glia tot neuronale culturen te ondersteunen. Echter, gliale co-cultuur of gliale-afgeleide geconditioneerde medium toegevoegd worden aan deze neuronale culturen om mechanismen de vorming van synapsen geïnduceerd door gliacellen 9, zoals studies beschreven door Pfrieger en Ba te onderzoekenrres 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Jonna Ellis voor de redactionele ondersteuning. Het beschreven project werd ondersteund door Award Aantal R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) van het National Institute of Mental Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Mental Health en de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0.5 mM | ||
| Table I. Neurobasal/B27 complete medium. | |||
| Glucose | 16 mM | ||
| Sucrose | 22 mM | ||
| HEPES | 10 mM | ||
| NaCl | 160 mM | ||
| KCl | 5 mM | ||
| Na2HPO4 | 1 mM | ||
| KH2PO2 | 0.22 mM | ||
| Gentamicin | 50 μg/ml | ||
| Fungizone | 250 ng/ml | ||
| pH | 7.4 | ||
| Osmolarity | 320-330 mOsm | ||
| Table II. Dissection medium. | |||
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 | ||
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 | ||
| Total | 490 | ||
| Table III. 50x Counting solution. | |||
| Hibernate E | Brainbits | 767171 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Glutamax 200 mM | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| TrypLE Express w/o phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 12604 | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Laminin 1 mg/ml | EMD Millipore | CC095 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250 | |
| Table IV. Specific reagents. | |||
| Stereo Microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B | |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 | |
| Razor-sharp scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6820 | |
| Micro Dissecting scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Micro Dissecting Curved scissors | Fine Science Tools | 14067-11 | |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 | |
| 60 mm dishes | BD Biosciences | 353002 | |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nalge Nunc international | 375353 | |
| Table V. Specific equipment. | |||
References
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , The MIT Press. Cambridge. (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
