1. Forberedelse Følgende Forsøkene ble utført i samsvar med The Duch komité for dyreforsøk. Forbereder mus for video-oculography. For å måle øyebevegelser av en mus, må leder av musen til å bli immobilisert. Derfor er en pidestall konstruksjon laget på skallen av musen (Figur 1). Anesthetize musen ved en blanding av isofluran (isofluran 1 til 1,5%; Rhodia Organique Fin Ltd, Frankrike) og oksygen i et gasskammer. Overdreven Gassen ryddet vekk. Opprettholde anestesi via nesen kjegle. Bekreft anestesidybden via en tå klype. Opprettholde kroppstemperaturen ved 37 ° C med bruk av en anal thermosensor og en varmepute (FHC, Bowdoinham, ME). Beskytt øynene ved å dekke dem med et øye salve (duratears, Alcon, Belgia). Barbere dorsal kranial pels, og rengjør det kirurgiske området med en rotasjon av kratt og betadine eller klorheksidin løsning. Lag en middels linje snitt å eksponere dorsal kraniale overflaten av skallen. Gjør overflaten ren og tørr. Påfør en dråpe fosforsyre (fosforsyre gel ets 37,5%, Kerr, CA) på dorsal kraniale overflaten av skallen fra bregma til lambda. Fjern ets etter 15 sekunder og gjør den kraniale overflaten ren med saltvann og tørr igjen. Påfør på toppen av denne etset hjernenerve overflaten en dråpe OptiBond Prime (Kerr, CA) og lufttørke det i 30 sekunder. Plasser en dråpe OptiBond lim (Kerr, CA) på toppen av OptiBond prime og kur med lys for 1 minutt (Maxima 480 synlig lysherding enhet; Henry Schein, USA). Dekk klebestoff med et tynt lag av Charisma kompositt (Heraeus Kulzer, Tyskland). Bygge to tilkoblede nøtter (diameter: 3 mm) i den sammensatte. Kurere den sammensatte etterpå med lys. Når det er nødvendig, påfør flere lag med kompositt og kurere dem med lys. AdMinister buprenorfin (0,015 mg / kg, sc) for postoperativ smertelindring. Dyret skal være tilbake på fote innen ca 5 min. La musen til å gjenopprette i hjemmet buret ved romtemperatur i minst 3 dager etter operasjonen. Video-oculography oppsett for mus (figur 2). Plasser musen i restrainer og fikse hodet til restrainer med to skruer (figur 1). Musen trenger ikke å være bedøvet for denne prosedyren. Besøksforbud tid bør ikke overstige 1 time / dag. Monter mus-hode-og-kroppen restrainer på en XY-plattform, som igjen er montert på dreieskiven (diameter: 60 cm). Bruke XY plattformen musa hodet kan plasseres over senter av tallerkenen. Musen kan flyttes over pitch, yaw og roll akser. Lederen for musen er plassert i riktig pitch, yaw og rullevinkelen ved å samkjøre øyet ved hjelp av det visuelle bildet av øyet som genereres av Iscan system. Alternativt kan pidestall konstruksjonen bli plassert på hodet til musen i en stereotactic ramme 11. Tallerkenen er festet til en AC servo-styrt motor (Harmonic stasjonen AG, Nederland) og plasseringen av dreieskiven overvåkes av et potensiometer (Bourns Inc., CA) festet til svingskiven aksen. En sylindrisk rundt skjermen (diameter: 63 cm, høyde: 35 cm) med en tilfeldig prikkete mønster (hvert element 2 °) dekker dreieskiven, denne trommen er også utstyrt med en AC servo-styrt motor (Harmonic stasjonen AG, Nederland) . Plasseringen av sylindriske skjermen overvåkes av et potensiometer (Bourns Inc., CA) festet til sin akse, og skjermen kan belyses ved en halogen lys (20 Watt). Både rundt skjermen og dreieskiven drives uavhengig av hverandre. Bevegelsen av dreieskive og omkringliggende skjermen styres av en datamaskin som er koblet til en I / O-grensesnitt (CED begrenset, Cambridge, Storbritannia). TaLuft og omkringliggende skjermposisjonen signaler blir filtrert (cut-off frekvens: 20 Hz), digitalisert av I / O-grensesnitt og lagres på denne datamaskinen. Øyet av musen er opplyst av tre infrarøde emittere (600 mW, spredningsvinkel: 7 °, peak bølgelengde: 880 nm, RS komponenter, Nederland). To infrarøde emittere er festet til svingskiven og den tredje emitter er festet til kameraet. Denne tredje emitter gir en referanse hornhinnen refleksjon (CR), som brukes under kalibreringen og under øyet bevegelse opptakene. Et infrarødt CCD kamera utstyrt med en zoom linse (6000 Zoom, Navitar Inc., NY) er festet til dreieskive og er fokusert på musen hodet i midten av tallerkenen. Kameraet kan låses opp og kan yawed om dreieskiven aksen enn nøyaktig 20 ° under kalibreringsprosedyren. Videosignalet blir behandlet av et øye tracking system (ETL-200, Iscan, Burlington, MA). Det Iscan systemet bruker en algorithm å spore sentrene for eleven og referansen CR. Systemet kan spore eleven og referansen CR i horisontal og vertikal retning på en samplingsfrekvens på 120 Hz. Referanse CR posisjon, elev stilling og størrelsen på pupillen signalene digitalisert av I / O-grensesnitt og lagres i samme fil som bordet og omkringliggende skjermposisjonen signaler. Videoen elev-tracking system induserer en forsinkelse av øyebevegelse signaler på ca 27 ms. 2. Kalibrering og Måle øyebevegelser Bruke Video Elev-sporing Øyet sporingssystem fanger bevegelsen av eleven som et translasjonsperspektiv bevegelse. Translasjonsforskning bevegelse spores eleven inneholder et translasjonsperspektiv, grunnet aksial forskjell mellom roterende midten av øyet og den anatomiske midten av øyet (dvs. sentrum av hornhinnen kurvatur), og en roterende komponent på grunn av kantete rotasjon av øyeeplet. Av TrekkIng referansen CR fra eleven bevegelse / posisjon, er uønsket translasjonsforskning komponenten elimineres fra signalet, som resulterer i et translasjonsperspektiv bevegelse som kun skyldes at rotasjonen av øyeeplet. Selv om de er ofte veldig små, eliminerer denne subtraksjon også oversettelser mellom hodet og kameraet. Den gjenværende isolerte translasjonell bevegelse blir konvertert til kantete rotasjon av øyeeplet med følgende brering 8,12. Denne kalibreringen ble utført før eventuelle øyebevegelser eksperiment. Juster musen hodet posisjonen til kameraet på en slik måte at videobildet av eleven ligger på midten av skjermen og at representasjon av referansen CR ligger på den vertikale midtlinjen av øyet fortrinnsvis direkte ovenfor eleven. Minimer bevegelser referansen CR grunn kantete kamera rotasjoner, som kan oppnås ved å plassere midt på hornhinnen kurvatur over kameraet / table akse. </ Li> Rotere kameraet flere ganger med + / – 10 ° (dvs. 20 grader topp til topp) rundt den vertikale aksen av tallerkenen. Bruk posisjonene til sporede eleven (P) og referansen CR registrert i ekstreme posisjoner kameraet rotasjon for å beregne radius av rotasjon av eleven (Rp, Rp = Δ / sin (20 °), hvor Δ = (CR -P), se figur 3A). På grunn av det faktum at Rp verdien avhenger av elev størrelse, trenger en elev størrelse korreksjon som skal gjennomføres 12 (Figur 3B). Gjenta trinn 2.2 mange ganger under ulike belysning forhold (dvs. manipulere eleven størrelse; figur 3C) for å bestemme pupillstørrelsen – Rp forholdet og komponere en Rp korreksjon kurve (Figur 3D). RP verdien avhenger også av den vertikale øye posisjon. Når forsøket vil føre til vertikale øyebevegelser da en korreksjon av kalibreringen for vertikale øye stillinger er svært anbefalelsesverdig13. Bestem kantete posisjon i øyet (E) ved å måle referansen CR posisjon, P posisjon og eleven størrelse. Referansen CR stillingen trekkes fra eleven posisjon generere et translasjonsperspektiv gratis elev posisjon. Ved å måle pupillstørrelsen RP verdien kan hentes ut fra Rp korreksjon kurven og E kan beregnes ved hjelp av følgende formel E = Arcsin {(Δ1) / Rp} (Figur 4A, hvor Δ1 = (P 2-P 1) og P 1 og P 2 er korrigert av subtraksjon av referansen CR). Et stort repertoar av dreieskive og / eller omkringliggende skjermen rotasjoner kan nå brukes til å stimulere oculomotor systemet. For å utføre video oculography i mørket, må musen øyet skal forbehandles med en miotisk stoff å begrense eleven dilatasjon og la eleven sporing under disse omstendighetene. I våre forsøk, bruker vi pilokarpin (4%, Laboratories Chauvin, Frankrike) for å begrense elev dilatasjon imørket. 3. Data Analysis Eye posisjoner, bord posisjoner og omkringliggende skjermen posisjoner er alle konvertert til kantete posisjoner (se figur 4B og formel i 2.4). Eye signaler er korrigert for deres forsinkelse på 27 ms indusert ved avbildning behandlingen av elev-sporingssystem. Kantet posisjoner i øyet, bord og rundt skjermen er differensiert og filtrert med et Butterworth low-pass filter med en cut off frekvens på 20 Hz. Saccades er fjernet fra øyet hastigheten signal ved hjelp av en deteksjonsgrensen på 40 ° / s. Dataene fjernes fra 20 ms før og opp til 80 ms etter å ha krysset deteksjonsgrensen. Bord, rundt skjermen og øye velocity signaler gjennomsnitt bruker hver enkelt syklus på stien (Figur 4C). Gjennomsnittlig signaler er utstyrt med en passende funksjon. Generelt er en sinusformet hastighet stimulering brukes og den gjennomsnittligesykluser er utstyrt med sinus eller cosinus funksjon (Figur 4C). Deretter kan gevinsten beregnes som forholdet mellom øyet hastighet til stimulans hastighet, mens den fasen kan beregnes som differansen (i grader) mellom øyet hastighet og stimulans hastighet. 4. Representative Resultater Video-oculography kan brukes til å undersøke ulike former for oculomotor forestillinger (dvs. optokinetic refleks: OKR; vestibulo-okulær refleks: VOR; visuelt forbedret vestibulo-okulær refleks: VVOR) samt motorisk læring (VOR tilpasning; OKR tilpasning). Den OKR kompenserer for lavfrekvente forstyrrelser med visuell tilbakemelding. Den OKR kan induseres ved å rotere godt opplyste rundt skjermen (Movie 1). Roterende rundt skjermen over et frekvensområde på 0,2 -1,0 Hz med en amplitude på 1,6 ° viser hvordan optokinetic systemet er en mer effektiv kompensatorisk mekanisme i lav-frekvensområdet than i high-frekvensområdet (Figur 5A). VOR kompenserer for høyfrekvente hodebevegelser med signaler fra det vestibulære organer. VOR kan bli indusert ved å rotere dyr (dvs. platespiller) i mørket (Movie 2). Rotere dreieskive over et frekvensområde på 0,2 -1,0 Hz med en amplitude på 1,6 ° demonstrerer hvordan vestibulo-okulære system er mer effektivt i å generere kompenserende øyebevegelser i high-frekvensområdet enn i lav-frekvensområdet (Figur 5A) . Når optokinetic og vestibulo-okulære system handle på konsert, kan bildene bli stabilisert på netthinnen over et bredt spekter av hodebevegelser. Rotere dreieskive over et frekvensområde på 0,2 -1,0 Hz med en amplitude på 1,6 °, mens det omkringliggende skjermen er godt belyst (Movie 3) viser hvordan øyet genererer "high gain" kompenserende bevegelser over hele frekvensområdet (Figur 5A ). Alle disse gevinst og phase verdier er typisk for mus, men kjønn 14 og belastning 15,16,17 forskjeller ble rapportert. Den uavhengige kontrollen over dreieskive og rundt skjermen gjør oss i stand til å konfrontere de mus med en mismatch mellom visuell og vestibulære informasjon. Etter en langvarig og ensartet eksponering ikke samsvarer visuell og vestibulære informasjon, vil VOR av musen endres for å kompensere for den endrede visuelle input (VOR tilpasning; Movie 4). Roterende dreieskiven ut av fase (dvs. 180 °) med rundt skjermen (1 Hz, 1,6 °) øker VOR gevinst (Figur 5B). Den maksimale endringen i VOR gevinst, ved bruk av en rettssak læring paradigme, ofte nådd etter 30 minutter. Figur 1. Skjematisk tegning av mus-hode-og-kropp restrainer. Liket av musen er behersket bruken plast sylindrisk rør med en diameter på 35 mm. Lederen for musen er immobilisert ved å koble den pidestallen av musen til jernstang med to skruer. Den jernstang gjør en vinkel på 30 grader for å posisjonere hodet på musen i normal banen i bevegelse og. *, Topp utsikt over sokkelen inneholder to muttere. Figur 2. Skjematisk tegning av musen video-oculography oppsett. Figur 3. Kalibrering av video elev-sporingssystem. A) Kameraet er rotert flere ganger med + / – 10 ° (dvs. 20 grader topp til topp) rundt den vertikale aksen av tallerkenen. Den sporede elev (P) og referansen hornhinnen refleksjon (CR) registrert i de ekstreme posisjoner kameraet rotasjon brukes til å beregne radius av rotasjon av elevens(RP). B) Den radius av eleven diameter er avhengig av størrelsen på eleven. C) Eksempel som viser effekten av eleven størrelse på elev stilling under kalibreringen (begge målt i piksler (px)). D) Forholdet mellom Rp og elev diameter målt i en enkelt mus. De tretten ulike elev diametre ble oppnådd ved å endre intensiteten på lyset i omgivelsene. Figur 4. Måling og analyse av øyebevegelser bruker video elev-sporing. A) Den kantete Eleven Stillingen er beregnet fra radius av eleven (RP) og posisjonen av Elev (P; korrigert for CR stilling). B) Eksempel på kompenserende øyebevegelser indusert ved å stimulere den vestibulære og visuelle system (visuell forbedret VOR). Tallerkenen var rotert sinusoidally på 0,6 Hz med en amplitude på 1,6 °, mens det omkringliggende skjermen var godt opplyst. C) Analyser av innspillingenvist i B). Grafen viser den gjennomsnittlige hastigheten spor av dreieskiven (blå) og elev (rød). Disse gjennomsnittlig sporene ble utstyrt med en sinusfunksjon (svart). Figur 5. Ytelse og læring av oculomotor system målt i en C57Bl6 mus. A) øyebevegelser er generert av rotasjoner av det omkringliggende skjermen (optokinetic Reflex: OKR, topplater), ved å rotere musen i mørket (vestibulo-okulær refleks: VOR, middels paneler) og ved å rotere musen i lyset (visuelt forbedret vestibulo-okulær refleks: VVOR, bunn panel) med frekvenser som strekker 0,2 til 1,0 Hz ved en amplitude på 1,6 °. Gevinsten av refleks ble beregnet som forholdet mellom øyet hastighet til stimulus hastighet (venstre panel) og fase av refleks ble beregnet fra faseforskjell mellom øyet hastighet og stimulans hastighet (høyre paneler). B) motorisk læring ble gjort ved automatisk inn øke VOR hjelp av en av fase trening paradigme. Musen var gjenstand for en visuovestibular trening paradigme hvor rotasjon av mus var ute av fase (180 °) med rotasjon av omkringliggende skjermen (både roterende på 1,0 Hz, 1,6 °) for førti minutter. Hvert 10. minutt VOR ble testet (1,0 Hz, 1,6 °). I denne musen ut av fase trening økte VOR gevinst. Movie 1. Animasjon som viser paradigmet som induserer OKR i mus Klikk her for å vise film . Movie 2. Animasjon som viser paradigmet som induserer VOR i mus. Klikk her for å vise film . Movie 3. Animasjon som viser paradigmet som induserer VVOR i mus..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> Klikk her for å vise film. Movie 4. Animasjon som viser visuovestibular ut av fase trening paradigme som induserer VOR tilpasning (økning) i mus. Klikk her for å vise film .