Summary
Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering, kultur og manipulation af muse embryonale pancreas. Dette repræsenterer en fremragende
Abstract
Bugspytkirtlen styrer vitale funktioner i vores krop, herunder produktion af fordøjelsesenzymer og regulering af blodsukkeret 1. Selv om der i det seneste årti mange undersøgelser har bidraget til et solidt grundlag for at forstå bugspytkirtlen organogenese, vigtige huller stadig i vores viden om tidlig pancreas formation 2. En fuldstændig forståelse af disse tidlige hændelser vil give indsigt i udviklingen af dette organ, men også ind i uhelbredelige sygdomme, der er målrettet bugspytkirtlen, såsom diabetes eller kræft i bugspytkirtlen. Endelig vil denne information generere en plan for udvikling af celle-udskiftning behandlingsformer i forbindelse med diabetes.
Under embryogenese, stammer bugspytkirtlen fra forskellige embryoniske udvækster på den dorsale og ventrale foregut endoderm på fosterdag (E) 9.5 i museembryo 3,4. Begge udvækster evaginate i det omgivende mesenkym som faststof epitell knopper, som undergår proliferation, forgrening og differentiering til at generere en fuldt moden orgel 2,5,6. Nylige beviser tyder på, at væksten og differentieringen af pankreatiske cellelinier, herunder de insulinproducerende β-celler, afhænger af korrekt vævs-arkitektur, epithelial remodellering og celle-placering i det forgrenings pancreas epitel 7,8. Men hvor forgrening morfogenese forekommer, og er koordineret med proliferation og differentiering i pancreas er stort set ukendt. Dette er til dels skyldes, at den nuværende viden om disse udviklingsprocesser har næsten udelukkende på en analyse af faste prøver, mens morfogenetiske begivenheder er meget dynamisk.
Her rapporterer vi en fremgangsmåde til at dissekere og dyrkning af muse embryonale pancreatisk buds ex vivo på glas bunden retter, som giver mulighed for direkte visualisering af det udviklende pancreas (figur 1). Denne kulture system er ideelt udtænkt til konfokal laserscanningsmikroskopi og især, live-cell imaging. Pancreas eksplantater kan fremstilles ikke blot af vildtype-museembryoer, men også fra gensplejsede musestammer (fx transgene eller knockout), hvilket muliggør tidstro studier af mutante fænotyper. Desuden er denne ex vivo-dyrkningssystemet er værdifuldt at undersøge effekten af kemiske forbindelser på pancreasudviklingen, gør det muligt at opnå kvantitative data om proliferation og vækst, forlængelse, forgrening, tubulogenesis og differentiering. Som konklusion, giver udviklingen af en ex vivo bugspytkirtlen eksplantat kultur metode kombineret med høj opløsning billeddannelse en stærk platform til at observere morfogenetiske og differentiering hændelser som de forekommer inden for udvikling museembryo.
Protocol
Protokollen beskrevet her, er blevet tilpasset fra den teknik, der oprindeligt blev beskrevet i Percival og Slack 9 og optimeret til konfokal mikroskopi.
1. Overfladebehandling af Glass Bottom dyrkningsskåle
De følgende trin bør udføres under sterile betingelser i et laminært stinkskab.
- Pancreas eksplantater dyrkes i 35 mm petriskåle med 20 mm diameter glass mikrobrønd bund (f.eks Mattek Corporation). Brug en glas bund fad per eksplantat kultur og for hele varigheden af kulturen. På dagen før dissektion og isolering af de pancreatiske knopper, belægge glas bunden mikrobrønde med fibronectin.
- Fortynd sterile fibronectin i cellekultur-kvalitetsvand til et 50 ug / ml slutkoncentration, og der tilsættes et minimalt volumen af det (~ 150 ul) i 20 mm mikrobrønd af Mattek plader dækker hele glasoverflade (fig. 1E). Anbringes de tre digleri et 4 ° C køleskab natten over inkubering.
- På dagen for dissektion, opsug fibronectin, skylles mikrobrønd med cellekultur-grade vand og tilsættes et minimalt volumen på 150 pi af BME (Basal Medium Eagle) medium suppleret med Pen / Strep (1%), glutamin (1% ) og 50 pg / ml Gentamicin [Dissection Medium]. Lad de coatede retter i laminar flow hætte indtil klar til plade eksplantaterne.
Hvis ikke alle fibronectin-coatede skåle anvendes, kan de opbevares i op til 1 uge ved 4 ° C. Lad ikke de retter tørre, fylde dem med dissektionsmedium og placere dem i køleskabet.
Ud over fibronectin, har pankreatiske eksplantater med held blevet dyrket på forskellige substrater, såsom laminin 9, matrigel 10,11 eller mikroporøse membraner 12. På grund af dens virkninger på forgrening, bruger vi fibronectin 9 som substrat.
2. Dissektion af Dorsal Pankreatisk Bud fra E11.5 - E12.5 musefostre
- Timet-drægtige mus på fosterdag (E) 11,5 eller 12,5 aflives og embryoner opsamles ved hjælp dissekere instrumenter tidligere renset med 70% ethanol. Placer dissekeret livmoderen i 10-cm plader indeholdende iskold PBS suppleret med 50 ug / ml gentamicin.
- Under et stereomikroskop med belysning fra oven, separat livmoderen i individuelle embryo segmenter ved hjælp af en lille saks eller Dumont tænger, blidt skræl væk en muskel i livmoderen og fjerne de enkelte embryoner, som er omgivet af decidua. Brug standard embryo dissektion teknikker 13 for at blotlægge de befrugtede æg og fjern blommesækken og amnion. Derefter fjernes overkroppen af embryoet (over leveren) og haleregionen. Dette vil tillade eksponering af indre organer (figur 1B). Overfør midt på kroppen af embryonerne i 10-cm plader indeholdende iskold BME dissektion medium.
- NuBrug kun gennemlysning nedefra at visualisere og at dissekere den dorsale bugspytkirtlen opløbet under stereomikroskop. Forsigtigt, skal du åbne midt på kroppen af embryonet ved at lave en lateral incision med pincet. Find maven og milten. Den dorsale pancreas bud er fastgjort sideværts til den bageste region af maven (figur 1C). Ved hjælp af Dumont pincet, dissekere væk dorsale bugspytkirtlen opløbet fra tilstødende strukturer, såsom mave og milt, men forlader nogle mesenkym rundt epitelet (Figur 1D). Under anvendelse af en glas Pasteur-pipette, den isolerede bud overføres til en 35 mm petriskål indeholdende koldt BME dissektion medium suppleret med 10% føtalt kalveserum [dyrkningsmedium]. Gentag disse trin, indtil alle pancreas er isolerede. Hvis pancreas af forskellige genotyper er isoleret, holde dem adskilt ved hjælp Nunc 4-brøndsplader.
3. Plating og Kultur Pancreas Eksplantater
Final platning af eksplantaterne udføres i vævskultur rum og / eller i tæt nærhed til vævsdyrkningsinkubator at minimere fysisk bevægelse af kulturerne.
- Under sterile betingelser i en laminar strømningshætte erstatte BME Dissection Medium i fibronectin-coatede Mattek retter med ~ 150 pi BME dyrkningsmedium forvarmes ved 37 ° C.
- Omhyggeligt, overføre pancreas eksplantater i coatede Mattek skåle (en eksplantat per skål) for langsigtet kultur ved hjælp af et glas Pasteur pipette. For at sikre spredning i løbet af kultur, kan mesenkymet omgiver eksplantaterne være lidt rippet, hvis det er nødvendigt, med en fin nål.
- Forsigtigt, placere kulturer i en vævskultur inkubator (37 ° C, 5% CO 2) for få timer at lade eksplantater tillægger glas bunden mikrobrønde. Når de er bundet, fylde Mattek skåle med 1,5 ml til 2 ml BME dyrkningsmedium forvarmes ved 37 ° C. Dagen for dissektion kaldes dag 0.
- Manipulation af pancreas eksplantatkulturer udføres under sterile betingelser i et laminært stinkskab. Den BME dyrkningsmedium ændres hver anden dag, medmindre eksperimentelle dikterer forskellige timing (f.eks inkubation af eksplantater med kemiske agenser). Eksplantaterne kan dyrkes i denne tilstand i 5 dage op til en uge.
4. Whole-mount immunfluorescensfarvning protokol for Pancreas Eksplantater
Alle trin af immunofluorescens-protokollen (fra fiksering til billeddannelse) udføres i den samme Mattek skålen, som giver bedre billeder end en plastik bund skålen. Efter fiksering, har pancreas eksplantatkulturer ikke skal holdes under sterile forhold.
- Aspirer BME dyrkningsmedium og vaskes eksplantatet gang med 2 ml 1X PBS.
- For eksplantat fiksering erstatte PBS med 2 ml iskold 4% paraformaldehyd (PFA), og sæt fadet på is i 20 min. Drej forsigtigt pladen rundt fra tid tiltid, men undgå rokkende platforme, som eksplantatet kan løsne.
- Fjern PFA og vask af eksplantatet tre gange med 2 ml 1X PBS i 10 min ved stuetemperatur (RT).
- Blok med 2 ml blokerende opløsning (1X PBS + 0,1% Triton-X + 3% Donkey serum) i mindst 30 min ved stuetemperatur.
- Fortynd primært antistof i blokeringsopløsning, og der tilsættes ~ 150 ul af fortynding direkte i 20-mm mikrobrønd af Mattek plader dækker hele eksplantat overflade til inkubering natten over ved 4 ° C. For at minimere fysiske bevægelser, tilsættes primært antistof til eksplantaterne direkte i kølerum (4 ° C). For at forhindre fordampning, før tilsætning af antistoffet, placere Mattek pladerne i et fugtigt kammer.
- Den næste dag fjernes antistofopløsningen, og vask tre gange med 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) i 30 minutter hver ved stuetemperatur.
- Fortynd sekundært antistof i blokeringsopløsning [i henhold til producentens anbefalinger, vi bruger æsel Alexa Fluor farvestoffer sekundært antiorganer på 1:750 fortynding], og der tilsættes ~ 150 ul af fortynding direkte i 20-mm mikrobrønd af Mattek plader, der dækker hele eksplantat overfladen, i 1-2 timer inkubation ved stuetemperatur i mørke. For nuklear kontrastfarvning omfatter Hoechst sammen med sekundært antistof fortynding. For at forhindre fordampning, før tilsætning af antistoffet, placere Mattek pladerne i et fugtigt kammer.
- Der vaskes tre gange med 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) i 30 minutter hver ved stuetemperatur.
- Før montering, vaskes en gang med 1X PBS til fjernelse af Tween-20. Montere ved tilsætning af en dråbe vandigt monteringsmedium (med anti-fading) i 20 mm mikrobrønd af Mattek plader. Forsigtigt, dække eksplantatet med et dækglas. Undgå luftbobler.
- Eksplantater på Mattek plader kan ses under standard fasekontrastmikroskopi eller konfokal mikroskopi, afhængigt af målene for eksperimentet. For konfokal mikroskopi analyse bruger vi et Zeiss LSM 700 inverteret indstilling. Indføre passende lasere til fluoroforer osed. Vælg et mål, der vil billedet det ønskede område af pancreas eksplantation. En 10X vand-nedsænkning mål er egnet til at holde hele eksplantat i synsfeltet. En 40x vand-eller olie-nedsænkning mål er egnede til at fokusere på bestemte områder af pancreas eksplantatet med større opløsning. Eksplantaterne kan være optisk sektioneret og derefter den erhvervede Z-stakke rekonstrueret i 3D, ved hjælp af passende software.
5. Live-cell imaging protokol af Pancreas Eksplantater
- Miljøkammer setup: Brug en miljømæssig kabinet og en lille rugekammeret [med temperatur og CO 2 kontrol], der sidder på mikroskop scenen. Korrekt dyrkning af embryoniske pancreas kræver en stabil temperatur på 37 ° C og en kontrolleret atmosfære af befugtet 5% CO2. Egnede kamre er tilgængelige fra flere leverandører (F.eks Zeiss, Nikon, Olympus). Saml ovnen kassen og tænder den ent mindst 1 time før billedet begynder at udstyret til at varme op og ækvilibrere CO2 indhold på 5%.
- For time-lapse imaging af pancreas eksplantatkulturer, bruger vi en Zeiss LSM 700 inverteret mikroskop. For lasere og objektiv udvælgelse se punkt 4,10.
- Lad pancreas eksplantatet vedhæfte godt til glas-bund fad, før du starter den direkte billedvisning. [Vi plejer at optræde live imaging startende på dag 1].
I en laminar strømningshætte, aspireres og erstatte eksplantatet medium med frisk BME dyrkningsmedium til at begynde med optimale næringsforhold. - Forsigtigt overføres eksplantaterne til mikroskopet rum og anbring Mattek skålen i rugekammeret i prøveholderen af konfokalt mikroskop.
- Forbered mål (fx tilføje olie eller vand-medium efter valg af fordybelse mål) og fokusere på området af interesse i eksplantatet. Luk miljøkammeret ordentligt. For at forhindre fordampning under tidsforskudtkøb med vand-nedsænkning mål, i stedet for vand, anbefales det at bruge viskose nedsænkning væsker, som er kommercielt tilgængelige (f.eks Zeiss Immersol W).
- Opsætning laser intensitet, Z-stack erhvervelse parametre og tidsinterval (se også Diskussion for fejlfinding). Starte eksperimentet.
- Efter billeddannelse, eksport Z stakke og alle tidspunkter og analysere dem ved hjælp af passende software (f.eks ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).
6. Repræsentative resultater
Dorsale pancreas knopper (med omgivende mesenkym) blev dissekeret fra museembryoer mellem E11.5 og E12.5 og udpladet direkte på glas bunden dyrkningsskåle (figur 1). Blodkar er til stede i mesenkymet omkring epitel og kan synliggøres ved immunfarvning for endothelial markør PECAM 12 (data ikke vist). Efter to dages kultur, pancreas eksplantater underwent betydelig vækst og begyndte at organisere sig i forgrenede epiteliale strukturer, hvis kerner var positive for pancreas transkriptionsfaktor, Pdx1 (Figur 2A-C). Den gennemsnitlige z-tykkelse pancreas eksplantater på dag 3 i kultur er 60-80 um. Overfladen og volumenet af eksplantaterne kan måles med passende software (f.eks Huygens). Morfologi og immunofluorescens analyser viste, at pancreas-eksplantater dyrkes under anvendelse af denne protokol blive gentaget vivo tidligt pancreas differentiering og morfogenetiske events 5,10,11,14 (figur 2). Pancreas eksplantater på dag 4 i kultur undergik typiske "tip og trunk" adskillelse af epithelet 8, viser cpa1 + progenitorceller på spidsen af de epiteliale grene (Figur 2C) og differentieret insulin + og glucagon + celler organiseret som klynger i bagagerummet (figur 2D ). Desuden har pancreatic epitel i ex vivo kulturer udviste korrekt cytoskelet organisation og celle polaritet, med apikal lokalisering af F-actin (figur 2E, med grønt) og b1-integrin på basalmembraner (figur 2E, med rødt).
At studere pancreas forgrening i realtime, blev embryonale pancreatiske eksplantater isoleret fra tofarvet fluorescerende reporter musestamme membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mT / mg; musestamme er tilgængelige på Jackson Laboratory) (figur 3). Stillbilleder fra en time-lapse film af MT / MG pancreas eksplantater dyrket i kultur er vist i figur 3. Lokaliseringen af mT fluorescerende protein til membranstrukturer beskriver cellemorfologi og muliggør løsning af fine cellulære processer, gør det muligt at spore celle remodellering og migration over tid.
Efter en 12-timers time-lapse eksperiment mT fluorescenssignal forbliver levedygtig og forværringCTabel, selv om dens intensitet nedsættes, sandsynligvis på grund af lysbeskadigelse (figur 3). Tekniske løsninger for at undgå eller reducere solskader og fototoksicitet diskuteres i Diskussion sektion.
Fig. 1. Skematisk fremstilling af den dorsale pancreas bud dissektion fra E12.5 museembryo. (A) Lysfelt billede af E12.5 museembryo. Overkroppen af embryoet (over leveren) og haleregionen fjernes til isolering af midten af legemet (B). Indsnit er vist ved røde punkterede linjer. (C) yderligere dissektion resulterer i eksponering af maven og tolvfingertarmen region (angivet ved den punkterede kasse). Den dorsale bugspytkirtlen opløbet (se rød prikket cirkel) er i bunden af maven og ved siden af milten primordium. Den dissekeret dorsale bugspytkirtlen opløbet (D) overføres med en Pasteur pipette ind i mikrobrønden af et glas bunden skaal indeholdende BME dyrkningsmedium (E, F). Forkortelser: STO (mave), sp (milt), dp (dorsale bugspytkirtlen opløbet), duo (duodenum). Scale bars, 1000 um (A, C).
Figur 2. Whole-mount konfokalt immunfluorescensanalyse af pancreas eksplantatkulturer. (A) brightfield billeder af pancreas-eksplantater på dag 1 og dag 2 i ex vivo-kultur. Rød stiplede linje angiver indledningen af forgrening af epithelet. (B) 3D rekonstruktion af hele-mount immunfarvning for Pdx1 på dag 3 bugspytkirtlen kultur. Pancreas eksplantater viste tubuli Pdx1 + celler undergår en omfattende forgrening med 48 hr af kulturer. (C) Whole-mount immunfarvning af dag 3 pancreas eksplantat med antistoffer mod den basolaterale membran markør E-cadherin (ECAD), tip progenitorceller markør, Carboxypeptidase 1 (Cpa1) og phospho-histon H3 (pHH3). Det meste af den mitotiske aktive pHH3 +-celler colocalize på de perifere tips med Cpa1 +-celler. Stiplet lines viser spidsen af grenene. (D) Whole-mount immunfarvning for hormonforstyrrende afstamning markører, insulin (Ins) og glucagon (Gluca) på dag 3. Gule pile angiver klynger af Ins + og Gluca +-celler. Inset (D '), højere forstørrelse på en af endokrine celleklynge. (E) Whole-mount immunfarvning af dag 3 pancreas eksplantat for Pdx1, β1 integrin (β1int) og F-actin (Fact). Mesenchymal-celler (stjerne) afbrudt blandt Pdx1-positive epitelceller. Illustrationerne i C, D og E er enkelt konfokale optiske sektioner af Z-serien. Scale bars, 100 uM (A, B), 50 uM (CE).
Figur 3. Repræsentant live-cell imaging af ex vivo-dyrket bugspytkirtlen eksplantation. (AD) Rammer fra en time-lapse film af en pancreatisk eksplantation fra en mT / mG mus transgene embryo. Time of imaging er vist i timer: minutter. Eksplantatet blev underkastet billeddannelse begyndende på dag 1. Z-stack billederblev opnået med en 40X olieimmersion mål hver 12 min i i alt 15 timer. Stiplede linjer angiver spidsen af filialer og grænsen mellem epitel og mesenkym. Scale bar, 50 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når bugspytkirtlen skæbne er angivet, pancreasstamfaderceller gennemgår omfattende proliferation, differentiering og morfogenese til sidst danne en moden og funktionel orgel 2,4. I øjeblikket finder hvordan forgrening sted i pancreas, og hvordan den er tilsluttet progenitor proliferation og differentiering er stort set ukendt. Pancreas eksplantatkulturer udgør et ideelt system til at belyse disse processer ex vivo 5,9,11. Ved at kombinere live-cell imaging med ex vivo eksplantater af tidlige pancreas knopper man kan få et klart billede af de begivenheder, der finder sted i løbet af bugspytkirtlen morfogenese i embryoet. Denne video artikel præsenteres en simpel metode til at etablere ex vivo kulturer af embryonale pancreas på et glas support, hvilket gør dem ideelle til hel-mount immunofluorescens og direkte billedvisning.
Talrige eksempler på anvendelse af ex vivo pankreatiske eksplantater til billeddannelse cell morfologi, vækst og differentiering er præsenteret her. Vigtigt, disse eksempler viser, at embryonale bugspytkirtler dyrkes ex vivo ved hjælp af denne protokol efterligner de tidlige stadier af in vivo embryonale pancreas udvikling 2,3. For eksempel initierer forgrening omkring 24 timer efter udpladning af E11.5 pancreas, som forventet in vivo (figur 2A). Mens morfogenese og celledifferentiering i kulturerne ligner den, der ses in vivo, den generelle vækst i eksplantaterne er ikke sammenlignelig, og betydeligt mindre end den, der ses i udviklingen af embryoet. Under dyrkningsbetingelserne er beskrevet her, pancreas eksplantater op med at vokse på dag 5 og undergår degeneration efter en uge (data ikke vist). Derfor er den rapporterede ex vivo dyrkning system er begrænset og bedre egnet til undersøgelse af tidlige aspekter af bugspytkirtlen organogenesen.
Vi præsenterer her eksempler på ex vivo kulturer thved vi etableret fra vildtype såvel som mt / mG reporter musefostre. Anvendelsen af et fluorescerende reporter stamme er uundværlig for real-time scanning, således at visualisering af cellulære og subcellulære strukturer og studier af deres dynamik i et 3D-miljø. For eksempel muliggør lokaliseringen af MT fluorescerende protein til membranstrukturer os til netop visualisere cellemorfologi og spor cell remodellering og migration over tid i pancreas eksplantater. En af de mest almindelige problem og begrænsning i live-cell imaging eksperimenter er lysbeskadigelse, som kan forekomme som resultat af gentagen udsættelse for fluorescens excitationsbelysning. I almindelighed skal man balancere billedkvalitet med den fototoksicitet i forbindelse med sine egne eksperimentelle indstillinger. For eksempel er at minimere lysbeskadigelse en mulighed for at reducere hyppigheden af billedbehandling og forøge tiden mellem på hinanden følgende rammer eller alternativt at optimere Z stakken erhvervelseved at reducere antallet af optiske skiver.
Endelig ex vivo dyrkning af embryoniske pancreas er et værdifuldt system til screening af kemiske forbindelser og deres virkninger på pancreasudviklingen. Forbindelsen eller faktorer kan tilsættes direkte til dyrkningsmediet, og de udviklingsmæssige effekter kan let vurderes under et mikroskop. Ved hjælp af data analyse software, kunne man endda opnå kvantitative data om spredning og vækst, forlængelse, forgrening, tubulogenesis og differentiering. Det er også muligt at anvende transgene eller knockout væv til at etablere organkulturer eller foretage hurtigere gain-og tab af funktion eksperimenter i eksplantater, for eksempel gennem lentivirus transduktion eller morpholino oligonukleotider, henholdsvis (data ikke vist). Alle disse tiltag vil gøre det muligt real-time undersøgelser af mutant fænotyper og yderligere forståelse af gen-regulerende net i udviklingslandene bugspytkirtlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forskning i Den Spagnoli lab. er finansieret af Helmholtz Association, FP7-IRG-2008-ENDOPANC tilskud og ERC-2009-Start HEPATOPANCREATIC Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
References
- Slack, J.
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
- Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
- Hick, A. -C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
- Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
- Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
- Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
- Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
