Summary
यहाँ, हम अलगाव, संस्कृति और माउस भ्रूणीय अग्न्याशय के हेरफेर के लिए एक विधि का वर्णन है. यह एक उत्कृष्ट प्रतिनिधित्व करता है
Protocol
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मूल पेर्सिवल और सुस्त 9 में वर्णित और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूलित तकनीक से अनुकूलित किया गया है.
1. गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन की कोटिंग
निम्नलिखित कदम एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत बाहर किया जाना चाहिए.
- अग्नाशय explants 35 मिमी पेट्री डिश में 20 मिमी व्यास गिलास microwell नीचे (जैसे मटेक निगम) के साथ संवर्धित कर रहे हैं. Explant संस्कृति के प्रति और संस्कृति की पूरी अवधि के लिए एक गिलास नीचे पकवान का प्रयोग करें. दिन और अग्नाशय कलियों, कोट fibronectin साथ गिलास नीचे microwells के विच्छेदन अलगाव के पहले.
- सेल संस्कृति ग्रेड पानी में एक 50 ग्राम / मिलीलीटर अंतिम एकाग्रता बाँझ fibronectin और पतला 20-मिमी मटेक पूरे कांच की सतह (चित्रा 1E) को कवर प्लेटों के microwell में यह की एक न्यूनतम मात्रा (~ 150 μl) जोड़ने. व्यंजन जगहरातोंरात ऊष्मायन के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में.
- विच्छेदन के दिन, fibronectin aspirate, सेल संस्कृति ग्रेड पानी के साथ microwell कुल्ला और BME के 150 μl (बेसल मध्यम ईगल) पेन / Strep (1%), Glutamine (1% के साथ पूरक माध्यम की एक न्यूनतम मात्रा जोड़ने ) और 50 ग्राम / एमएल Gentamicin [विच्छेदन मध्यम]. लामिना का प्रवाह हुड में लेपित व्यंजन explants थाली के लिए तैयार है जब तक छोड़ दें.
यदि fibronectin लेपित नहीं व्यंजन सभी का उपयोग किया जाता है, वे के लिए भंडारित किया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए बर्तन सूखी, उन्हें विच्छेदन मध्यम के साथ भरने और उन्हें फ्रिज में जगह मत देना.
Fibronectin के अलावा, अग्नाशय explants सफलतापूर्वक किया गया है laminin 9, 10,11 Matrigel या microporous 12 झिल्ली के रूप में विभिन्न substrates पर सुसंस्कृत. शाखाओं में बंटी पर इसके प्रभाव की वजह से, हम सब्सट्रेट के रूप में 9 fibronectin का उपयोग करें.
2. डी के विच्छेदनE11.5 से orsal अग्नाशय - बड - E12.5 माउस भ्रूण
- भ्रूण (ई) दिन 11.5 या 12.5 समय गर्भवती मादा चूहों का बलिदान और भ्रूण विदारक पहले 70% इथेनॉल के साथ साफ उपकरणों का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं. 10 सेमी बर्फ ठंड 50 ग्राम / मिलीलीटर gentamicin के साथ पूरक पीबीएस युक्त प्लेटों में dissected गर्भाशय रखें.
- ऊपर, अलग गर्भाशय से व्यक्ति भ्रूण छोटी कैंची या Dumont संदंश धीरे छील दूर गर्भाशय की मांसपेशियों और व्यक्ति भ्रूण को निकालने के लिए, जो पत्या से घिरे रहे हैं, का उपयोग करते हुए क्षेत्रों में रोशनी के साथ एक stereomicroscope के तहत. मानक भ्रूण विच्छेदन तकनीक 13 का प्रयोग करने के लिए भ्रूण को बेनकाब करने के लिए और जर्दी थैली और भ्रूणावरण हटायें. बाद में, भ्रूण के शरीर के ऊपरी हिस्से (यकृत) के ऊपर और पूंछ क्षेत्र को हटा दें. यह भीतरी अंगों (चित्रा 1 बी) के निवेश की अनुमति होगी. 10 सेमी ठंडा BME विच्छेदन मध्यम युक्त प्लेटों में भ्रूण के शरीर के मध्य स्थानांतरण.
- अबके लिए कल्पना और stereomicroscope तहत पृष्ठीय अग्नाशय कली काटना नीचे से केवल transillumination का उपयोग. धीरे, संदंश के साथ एक पार्श्व चीरा द्वारा भ्रूण के मध्य शरीर खोलने. पेट और तिल्ली ढूँढ़ें. पृष्ठीय अग्नाशय कली laterally पेट के पीछे क्षेत्र (चित्रा 1C) से जुड़ा हुआ है. Dumont संदंश का प्रयोग, पेट और प्लीहा के रूप में आसन्न संरचनाओं से दूर पृष्ठीय अग्नाशय कली काटना, लेकिन उपकला आसपास कुछ mesenchyme छोड़ने (चित्रा 1D). एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक 35 मिमी पेट्री डिश में ठंड BME विच्छेदन 10% भ्रूण बछड़ा [संस्कृति मध्यम] सीरम के साथ पूरक मध्यम युक्त पृथक कली हस्तांतरण. इन चरणों को दोहराएँ जब तक सभी pancreata को अलग कर रहे हैं. यदि अलग जीनोटाइप pancreata अलग कर रहे हैं, उन्हें प्लेटों 4-अच्छी तरह Nunc का उपयोग कर अलग रखना.
3. चढ़ाना और अग्नाशय explants के संस्कृति
अंतिम बेनीexplants आईएनजी में टिशू कल्चर कमरे और / या टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में करीब निकटता में संस्कृतियों का भौतिक आंदोलन को कम किया जाता है.
- एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत fibronectin लेपित ~ BME संस्कृति के माध्यम के 150 μl के साथ मटेक व्यंजन 37 पर पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस में BME विच्छेदन मध्यम की जगह
- ध्यान से, लंबी अवधि के संस्कृति के लिए लेपित मटेक (पकवान प्रति एक explant) एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग व्यंजन में अग्नाशय explants हस्तांतरण. संस्कृति के दौरान फैलने सुनिश्चित करने के लिए, आसपास explants mesenchyme थोड़ा एक ठीक सुई के साथ किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो तो, फट.
- धीरे, एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में संस्कृतियों जगह (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) कुछ घंटों के लिए explants गिलास नीचे microwells देते. एक बार जब वे संलग्न कर रहे हैं, 37 पर पूर्व गरम BME संस्कृति के माध्यम के 1.5 मिलीलीटर 2 मिलीलीटर के साथ मटेक व्यंजन ° भरने के सी. विच्छेदन के दिन 0 दिन के रूप में जाना जाता है.
- आदमीअग्नाशय के explant संस्कृतियों के ipulation बाहर एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है. BME संस्कृति के माध्यम हर दूसरे दिन बदल जाता है, जब तक प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अलग अलग समय के साथ रासायनिक एजेंटों explants (जैसे ऊष्मायन) का हुक्म. explants इस हालत में 5 दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है एक सप्ताह के लिए.
4. पूरे माउंट अग्नाशय explants इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल
इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के सभी कदम (निर्धारण से इमेजिंग) एक ही मटेक डिश है, जो एक पकवान प्लास्टिक तली से बेहतर छवियों पैदावार में किया जाता है. निर्धारण के बाद, अग्नाशय explant संस्कृतियों बाँझ शर्तों के तहत रखा होने की जरूरत नहीं है.
- BME संस्कृति के माध्यम Aspirate और explant 2 मिलीलीटर 1X पीबीएस के साथ एक बार धो.
- Explant निर्धारण के लिए 2 मिलीलीटर ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ PBS जगह और बर्फ पर 20 मिनट के लिए पकवान जगह. प्लेट के लिए समय से धीरे भंवरसमय है, लेकिन कमाल प्लेटफार्मों से बचने के लिए, explant के रूप में अलग हो सकता है.
- निकालें और पीएफए 1X पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ कमरे के तापमान (आर टी) को 10 मिनट के लिए explant तीन बार धो लो.
- 2 मिलीलीटर अवरुद्ध समाधान के साथ ब्लॉक (1X पीबीएस + 0.1% ट्राइटन-X + 3% सीरम गधा) RT कम से कम 30 मिनट के लिए.
- समाधान को रोकने में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला और कमजोर पड़ने के 150 μl 20 मिमी मटेक प्लेटों के microwell 4 पर रात भर ऊष्मायन के लिए पूरे explant सतह डिग्री सेल्सियस को कवर में सीधे जोड़ शारीरिक गतिविधियों को कम करने के लिए, ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में सीधे explants प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने. वाष्पीकरण को रोकने के लिए, एंटीबॉडी जोड़ने से पहले, एक नम चैम्बर में मटेक प्लेटें जगह.
- अगले दिन एंटीबॉडी समाधान को हटाने और 2 मिलीलीटर 1X पीबीएस के साथ तीन बार धो + 0.1% बीच 20 आरटी पर 30 मिनट के लिए (पीबीटी).
- समाधान को रोकने में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला [निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, हम गधा Alexa Fluor रंजक माध्यमिक विरोधी का उपयोग करें1:750] कमजोर पड़ने और कमजोर पड़ने के 150 μl 20 मिमी मटेक प्लेटों के microwell, आरटी पर अंधेरे में 1-2 घंटा ऊष्मायन के लिए पूरे explant सतह को कवर में सीधे जोड़ने में निकायों. परमाणु counterstaining लिए, Hoechst माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ एक साथ शामिल है. वाष्पीकरण को रोकने के लिए, एंटीबॉडी जोड़ने से पहले, एक नम चैम्बर में मटेक प्लेटें जगह.
- 2 मिलीलीटर 1X पीबीएस के साथ तीन बार धोएं + 0.1% 30 मिनट आरटी में प्रत्येक के लिए Tween-20 (पीबीटी).
- बढ़ते पहले, 1X पीबीएस के साथ धोने के लिए एक बार Tween-20 हटाने. जलीय बढ़ते मध्यम की एक बूंद (विरोधी लुप्त होती के साथ) में 20 मिमी मटेक प्लेटों के microwell जोड़कर माउंट. धीरे, एक गिलास coverslip साथ explant कवर. हवाई बुलबुले से बचें.
- मटेक प्लेटों पर explants मानक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी या confocal माइक्रोस्कोपी के तहत प्रयोग के लक्ष्यों के आधार पर देखा जा सकता है. Confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए हम एक Zeiss LSM 700 औंधा सेटिंग का उपयोग करें. Fluorophores के लिए उपयुक्त लेज़रों हमें सेटएड. एक उद्देश्य का चयन करें कि अग्नाशय explant के वांछित क्षेत्र छवि होगा. एक 10x उद्देश्य पानी विसर्जन देखने के क्षेत्र में पूरे explant रखने के लिए उपयुक्त है. 40X पानी या तेल विसर्जन उद्देश्यों के लिए संकल्प के साथ अधिक से अधिक अग्नाशय explant के विशिष्ट क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयुक्त हैं. explants ऑप्टिकली sectioned और फिर हासिल कर ली जेड के ढेर 3 डी में खंगाला, उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है.
5. लाइव सेल अग्नाशय explants की इमेजिंग प्रोटोकॉल
- पर्यावरण कक्ष स्थापना: एक पर्यावरण संलग्नक और एक छोटे से ऊष्मायन चैम्बर कि खुर्दबीन मंच पर बैठता तापमान और सीओ 2 नियंत्रण के साथ उपयोग करें. भ्रूण अग्न्याशय के समुचित संवर्धन 37 डिग्री सेल्सियस और humidified 5% सीओ 2 के एक नियंत्रित वातावरण की एक स्थिर तापमान की आवश्यकता होती है. उपयुक्त कक्षों कई विक्रेताओं से उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, Zeiss, Nikon, ओलिंप). हीटर बॉक्स इकट्ठा और यह एक पर बारीटी इमेजिंग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए उपकरण को गर्म करने के लिए और 5% सीओ 2 सामग्री समभार बनाना अनुमति शुरू होता है.
- अग्नाशय explant संस्कृतियों के समय चूक इमेजिंग के लिए, हम एक Zeiss LSM 700 औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. 4.10 लेज़रों और उद्देश्य चयन के लिए बात को देखने के.
- अग्नाशय explant रहते इमेजिंग शुरू करने से पहले अच्छी तरह से गिलास नीचे पकवान देते हैं. [हम आम तौर पर रहते इमेजिंग 1 दिवस पर शुरू करने के].
एक लामिना का प्रवाह हुड में aspirate, और ताजा BME संस्कृति माध्यम इष्टतम पोषक तत्वों की शर्तों के साथ शुरू करने के साथ explant मध्यम की जगह. - धीरे खुर्दबीन कमरे explants हस्तांतरण और ऊष्मायन कक्ष में confocal खुर्दबीन का नमूना धारक में मटेक पकवान जगह.
- उद्देश्य तैयार (जैसे विसर्जन उद्देश्य की पसंद के अनुसार तेल या पानी के माध्यम से जोड़ने के लिए) और explant में ब्याज के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित किया है. पर्यावरण कक्ष ठीक से बंद करें. समय व्यतीत हो जाने के दौरान वाष्पीकरण को रोकने केपानी विसर्जन उद्देश्यों के साथ पानी की जगह में अधिग्रहण, यह चिपचिपा विसर्जन तरल पदार्थ है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (जैसे Zeiss Immersol डब्ल्यू) का उपयोग करने की सिफारिश की है.
- लेजर तीव्रता, Z-ढेर अधिग्रहण मानकों और समय अंतराल (समस्या निवारण के लिए भी चर्चा देखें) सेट. प्रयोग शुरू करो.
- इमेजिंग, निर्यात Z ढेर और हर समय अंक के बाद और उन्हें विश्लेषण उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens) का उपयोग.
6. प्रतिनिधि परिणाम
पृष्ठीय अग्नाशय कलियों (एक साथ आसपास के mesenchyme साथ) E11.5 और E12.5 और गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन (1 चित्रा) पर सीधे मढ़वाया के बीच माउस भ्रूण से dissected थे. रक्त वाहिकाओं mesenchyme उपकला आसपास में मौजूद हैं और endothelial मार्कर Pecam 12 (नहीं दिखाया डेटा) के लिए immunostaining द्वारा देखे जा सकते हैं. संस्कृति, अग्नाशय und explants के दो दिनों के बादमहत्वपूर्ण विकास erwent और खुद branched उपकला संरचनाओं, जिसका नाभिक अग्नाशय प्रतिलेखन कारक के लिए सकारात्मक थे Pdx1 (चित्रा 2A-C) में आयोजन शुरू कर दिया. संस्कृति के 3 दिन पर औसत अग्नाशय explants के z-मोटाई 60-80 सुक्ष्ममापी है. explants की सतह की मात्रा उपयुक्त सॉफ्टवेयर (Huygens जैसे) का उपयोग कर मापा जा सकता है. आकृति विज्ञान और immunofluorescence विश्लेषण से पता चला है कि अग्नाशय explants यह vivo प्रारंभिक अग्नाशय के भेदभाव और morphogenetic 5,10,11,14 घटनाओं (2 चित्रा) में recapitulated प्रोटोकॉल का उपयोग कर सुसंस्कृत. संस्कृति के 4 दिन पर अग्नाशय explants ठेठ "टिप और ट्रंक" 8 उपकला के अलगाव, प्रदर्शित करने cpa1 + पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (चित्रा 2 डी उपकला शाखाओं (चित्रा 2C) और विभेदित इंसुलिन + और ग्लूकागन + कोशिकाओं ट्रंक अंदर समूहों के रूप में संगठित के सुझावों पर लिया ). इसके अलावा, pancreatiपूर्व vivo संस्कृतियों में ग उपकला F-actin के शिखर स्थानीयकरण (चित्रा 2E, हरे रंग में) है और बेसल झिल्ली (लाल रंग में चित्रा 2E,) में B1-Integrin के साथ उचित cytoskeleton संगठन और सेल polarity दिखाया.
(माउस तनाव जैक्सन प्रयोगशाला में उपलब्ध है / मीट्रिक टन एमजी) (चित्रा 3) realtime में शाखाओं में बंटी अग्नाशय का अध्ययन, भ्रूण अग्नाशय explants दोहरी रंग फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस तनाव 15 membrane-Tomato/membrane-Green से अलग थे. मीट्रिक टन / मिलीग्राम अग्नाशय संस्कृति में विकसित explants समय चूक की एक फिल्म से अभी भी फ्रेम 3 चित्र में दिखाया जाता है. मीट्रिक टन झिल्ली संरचनाओं के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का स्थानीयकरण सेल आकारिकी रूपरेखा और सेलुलर प्रक्रियाओं के ठीक संकल्प की अनुमति देता है, समय के साथ सेल remodeling और प्रवास ट्रैक सक्षम है.
एक 12-घंटा प्रयोग समय व्यतीत हो जाने के बाद माउंट प्रतिदीप्ति संकेत व्यवहार्य और देते रहता हैctable, हालांकि इसकी तीव्रता कम है, सबसे photodamage के कारण होने की संभावना (3 चित्रा). तकनीकी समाधान से बचने के लिए या photodamage और phototoxicity कम चर्चा अनुभाग में चर्चा कर रहे हैं.
चित्रा 1 E12.5 माउस भ्रूण से पृष्ठीय अग्न्याशय कली विच्छेदन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) E12.5 माउस भ्रूण की Brightfield छवि. भ्रूण (यकृत) के ऊपर और पूंछ क्षेत्र के ऊपरी शरीर शरीर मध्य (बी) को अलग हटा रहे हैं. चीरों लाल बिंदीदार लाइनों द्वारा दिखाए जाते हैं. (सी) (बिंदीदार बॉक्स द्वारा इंगित) पेट और ग्रहणी क्षेत्र की जोखिम में आगे विच्छेदन परिणाम है. पृष्ठीय अग्नाशय कली (लाल डॉटेड सर्कल देखें) पेट और तिल्ली उत्स के पास के आधार पर है. dissected पृष्ठीय अग्नाशय कली (डी) एक पाश्चर विंदुक के साथ एक गिलास नीचे पकवान BME संस्कृति मध्यम युक्त microwell (ई में स्थानांतरित कर रहा है, एफ). Abbreviations: sto (पेट), सपा (तिल्ली), डी पी (पृष्ठीय अग्नाशय कली), जोड़ी (ग्रहणी). स्केल सलाखों, 1000 सुक्ष्ममापी (ए, सी).
चित्रा 2 पूरे माउंट अग्नाशय explant संस्कृतियों के confocal immunofluorescence विश्लेषण. (ए) 1 दिन और पूर्व vivo संस्कृति के 2 दिन पर अग्नाशय explants के Brightfield छवियों. लाल बिंदीदार रेखा उपकला की शाखाओं में बंटी की दीक्षा को इंगित करता है. (बी) पूरे माउंट 3D पुनर्निर्माण दिन 3 अग्नाशय संस्कृति पर Pdx1 लिए immunostaining. अग्नाशय explants संस्कृतियों के 48 घंटा से व्यापक शाखाओं में बंटी के दौर से गुजर Pdx1 + कोशिकाओं के tubules दिखाया. (सी) झिल्ली basolateral मार्कर ई cadherin (Ecad), टिप पूर्वज मार्कर, 1 Carboxypeptidase (Cpa1) और phospho histone H3 (pHH3) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ 3 दिन अग्नाशय explant immunostaining पूरे माउंट. सक्रिय mitotic pHH3 + कोशिकाओं के अधिकांश Cpa1 + कोशिकाओं के साथ परिधीय सुझावों पर colocalize. डैश्ड एलines संकेत मिलता है शाखाओं के टिप. (डी) endocrine वंश मार्करों, इंसुलिन (आईएनएस) और 3 दिन में ग्लूकागन (Gluca) के लिए पूरे माउंट immunostaining. पीले तीर इन्स के समूहों + और Gluca + कोशिकाओं से संकेत मिलता है. इनसेट (डी '), एक endocrine सेल क्लस्टर के उच्च बढ़ाई. (ई) Pdx1, β1 (β1int) Integrin और एफ actin (तथ्य) के लिए पूरे माउंट दिन 3 अग्नाशय explant immunostaining. Mesenchymal कोशिकाओं (तारांकन) Pdx1 सकारात्मक उपकला कोशिकाओं के बीच interspersed. सी, डी और ई में दिखाया छवियाँ Z-श्रृंखला के एकल confocal ऑप्टिकल वर्गों हैं. स्केल सलाखों, 100 (ए, बी) सुक्ष्ममापी, 50 सुक्ष्ममापी (सीई).
चित्रा 3 पूर्व vivo सुसंस्कृत अग्नाशय explant के प्रतिनिधि रहते सेल इमेजिंग. (ई.) एक लाख टन / एमजी माउस ट्रांसजेनिक भ्रूण से एक अग्नाशय explant समय चूक की एक फिल्म से फ्रेम्स. मिनट इमेजिंग के समय घंटे में दिखाया गया है. explant 1 दिन में शुरू imaged किया गया था. Z-ढेर छवियोंएक 40X तेल विसर्जन उद्देश्य 15 घंटा की कुल के लिए हर 12 मिनट के साथ हासिल किया गया. धराशायी लाइनों और शाखाओं उपकला और mesenchyme के बीच सीमा के टिप से संकेत मिलता है. स्केल बार, 50 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
एक बार अग्नाशय भाग्य निर्दिष्ट किया जाता है, अग्नाशय पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं व्यापक प्रसार, भेदभाव और morphogenesis अंततः एक परिपक्व और कार्यात्मक 2,4 अंग फार्म से गुजरना. वर्तमान में, कैसे शाखाओं में बंटी अग्न्याशय में जगह लेता है और कैसे यह पूर्वज प्रसार और भेदभाव से जुड़ा है काफी हद तक अज्ञात है. अग्नाशय explant संस्कृतियों का एक आदर्श प्रणाली इन प्रक्रियाओं को स्पष्ट पूर्व 5,9,11 vivo का प्रतिनिधित्व करते हैं. पूर्व vivo जल्दी अग्नाशय कलियों के explants साथ जीना सेल इमेजिंग के संयोजन के द्वारा एक घटनाओं है कि अग्न्याशय morphogenesis में भ्रूण के दौरान जगह ले का एक स्पष्ट चित्र प्राप्त कर सकते हैं. इस वीडियो लेख एक सरल करने के लिए एक गिलास का समर्थन है, जो उन्हें पूरे माउंट immunofluorescence और रहते इमेजिंग के लिए आदर्श बनाता पर भ्रूण अग्न्याशय के पूर्व vivo संस्कृतियों की स्थापना के दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है.
इमेजिंग ग के लिए पूर्व vivo अग्नाशय explants के उपयोग के कई उदाहरण हैंपक्ष आकारिकी विकास, और भेदभाव यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं. महत्वपूर्ण बात, इन उदाहरणों से पता चलता है कि भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व इस प्रोटोकॉल का उपयोग vivo भ्रूण अग्न्याशय 2,3 विकास के प्रारंभिक दौर की नकल vivo pancreases. उदाहरण के लिए, शाखाओं में बंटी E11.5 अग्न्याशय के चढ़ाना के बाद लगभग 24 घंटे शुरू की है, के रूप में vivo (2A चित्रा) में होने की उम्मीद है. जबकि morphogenesis और संस्कृतियों में सेल भेदभाव निकट जैसा दिखता है कि vivo में देखा, explants के समग्र विकास तुलनीय और काफी विकासशील भ्रूण में देखा है कि कम से कम नहीं है. संस्कृति शर्तों के तहत यहाँ वर्णित, अग्नाशय explants 5 दिन में बढ़ बंद करो और एक सप्ताह (नहीं दिखाया डेटा) के बाद पतन से गुजरना. इसलिए, सूचना पूर्व vivo संवर्धन प्रणाली और सीमित बेहतर अग्न्याशय जीवोत्पत्ति के शुरुआती पहलुओं की जांच के लिए अनुकूल है.
हम यहाँ पूर्व vivo संस्कृतियों वें के उदाहरण प्रस्तुतहम जंगली प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मीट्रिक टन / एमजी संवाददाता माउस भ्रूण से स्थापित. एक फ्लोरोसेंट पत्रकार तनाव का उपयोग वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अपरिहार्य है, सेलुलर और subcellular संरचनाओं और एक 3 डी वातावरण में उनकी गतिशीलता के अध्ययन के दृश्य को सक्षम. उदाहरण के लिए, मीट्रिक टन झिल्ली संरचनाओं के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का स्थानीयकरण हमें ठीक सेल आकारिकी और ट्रैक सेल और अग्नाशय के explants में समय पर remodeling प्रवास कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है. सबसे आम है और जीवित कोशिका इमेजिंग प्रयोगों में समस्या सीमा की photodamage है कि दोहराया प्रतिदीप्ति उत्तेजना रोशनी के लिए जोखिम का एक परिणाम के रूप में हो सकता है. सामान्य में, एक के लिए अपने स्वयं के प्रयोगात्मक सेटिंग्स के संदर्भ में phototoxicity साथ छवि गुणवत्ता संतुलन है. उदाहरण के लिए, photodamage एक संभावना को कम करने के लिए इमेजिंग की आवृत्ति को कम करने के लिए बढ़ाने के लिए और लगातार फ्रेम या, वैकल्पिक रूप से के बीच का समय व्यतीत हो जाने के Z ढेर अधिग्रहण का अनुकूलन हैऑप्टिकल स्लाइस की संख्या को कम करने से.
अंत में, भ्रूण अग्न्याशय के पूर्व vivo संवर्धन स्क्रीनिंग रासायनिक यौगिकों और अग्नाशय के विकास पर उनके प्रभाव के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है. परिसर या कारकों संस्कृति के माध्यम से सीधे जोड़ा जा सकता है और विकास के प्रभाव को आसानी से एक खुर्दबीन के नीचे मूल्यांकन किया जा सकता है. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना है, एक भी प्रसार और विकास, बढ़ाव, शाखाओं में बंटी, tubulogenesis और भेदभाव के बारे में मात्रात्मक डेटा प्राप्त कर सकता है. यह भी संभव है ट्रांसजेनिक या पीटा ऊतकों का उपयोग करने के लिए अंग संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए या बाहर ले जाने के लाभ और हानि के समारोह तेजी explants प्रयोगों में, उदाहरण के लिए lentivirus पारगमन या morpholino oligonucleotides के माध्यम से, क्रमशः (नहीं दिखाया डेटा). इन सभी दृष्टिकोणों उत्परिवर्ती phenotypes और विकासशील अग्न्याशय में जीन विनियामक नेटवर्क के आगे समझने की वास्तविक समय अध्ययन की अनुमति होगी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
में अनुसंधान Spagnoli प्रयोगशाला. Helmholtz एसोसिएशन, FP7-IRG-2008-ENDOPANC अनुदान और ईआरसी-2009-शुरू HEPATOPANCREATIC अनुदान द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
References
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