Summary
被描述的CD4枚举法，α测试，它采用全唾液，以提供快速，准确的CD4细胞计数。 α-测试成本便士和消除技术培训，如昂贵的试剂，单克隆抗体，仪器仪表，制冷，样品运输，以及收集和处理血液的需要。
Abstract
有负担得起的CD4枚举监测HIV疾病的迫切需要。的CD4枚举是在资源有限的地区，由于时间和温度的限制，技术复杂，试剂成本，尤其是单克隆抗体的血细胞，目前唯一可以接受的方法来衡量的CD4遥不可及。节约成本和节省时间的一种常用实验室的策略，而不是衡量某些血液值，是计算。例如，低密度脂蛋白水平计算，总胆固醇，高密度脂蛋白（HDL），甘油三酯1使用的测量水平。因此，确定无细胞的相关因素，直接调节的CD4 + T细胞可以提供一个准确的方法，计算CD4计数由于生理意义的相关因素。
进入血液，并注定要成为循环CD4 + T细胞的干细胞数量确定的趋化因子CXCL12的1ND及其受体CXCR4，由于他们对运动2的影响。此外，进入血液干细胞的运动过程调节细胞表面人类白细胞弹性蛋白酶（HLE CS）和HLE CS-反应活性α1蛋白酶抑制剂（α1有价证券，α1抗胰蛋白酶，SerpinA1）3。在HIV-1病毒病，α1 PI灭活由于疾病的进程4。 α1 PI在HIV-1疾病的早期症状类别，积极发现低于100％未经治疗的HIV-1患者（中位数= 12μM，以及达到正常水平，在对症4大类，5正常。格局已被归因于免疫灭活，不足够的合成，蛋白失活，或充氧。我们观察到，在HIV-1> 220的CD4细胞/μl的科目，CD4细胞计数了积极的α1 PI水平呈正相关（R 2 = 0.93，P＆LT; 0.0001，N = 26）和无效的α1的PI（R 2 = 0.91，P <0.0001，N = 26）5。 α1的PI HIV-1感染和未感染者的管理，导致在α1 PI参与调节的CD4 + T细胞，血液中的3中的CD4计数显着增加。
与刺激，全唾液中含有足够的浆液性渗出物（血浆含有蛋白质的物质通过血管壁进入唾液传递）允许测量活性α1 PI与此测量的相关性的证据表明，它是一种精确的方法计算CD4细胞计数。简言之，如嚼口香糖或柠檬酸sialogogues刺激到整个口腔唾液，血清渗出。刺激血清渗出后，血清α1 PI唾液中的活性是衡量其能力，抑制弹性蛋白酶的活性。猪胰弹性蛋白酶（PPE）的弹性蛋白酶是一个现成的廉价来源。个人防护装备的α1有价证券结合形成一个到一个复杂的，防止切割其特定的底物，其中之一是的比色法肽，琥珀- L-丙氨酸-L-丙氨酸- L-丙氨酸-P-硝基苯胺（SA的个人防护装备3不适用）。孵化器为在室温下10分钟的个人防护装备的饱和浓度的唾液，允许个人防护装备的所有活动α1 PI唾液中的约束力。可以衡量的PPE抑制活性α1有价证券加入的PPE基板SA的3不适用。（图1）。虽然CD4细胞计数测量血容量（CD4细胞/μL），α1 PI唾液中的浓度与唾液中的血清浓度，唾液量，因为体积可以改变白天和人大大6人。然而，几乎所有的唾液中的蛋白质是由于血清含量，唾液中的蛋白质含量是测量surable 7。因此，活性α1 PI唾液中的唾液蛋白质含量的比率计算，被称为α1 PI指数。结果提出此表明，α1 PI指数提供了一个准确和精确的计算CD4细胞计数的生理方法。
Protocol
1。准备新鲜的工作方案
- TBS电视台：0.05 mol的Tris缓冲液，pH值7.8公司（TBS）。准备60毫升TBS /微孔板。
- 个人防护装备：猪胰弹性蛋白酶，1型（PPE）的暂停。摇匀，稀释约0.01 U / ml的个人防护装备在TBS。准备6毫升工作液/微孔板）。
- SA的3 NA：琥珀- L-丙氨酸-L-丙氨酸- L-丙氨酸-P-硝基苯胺（SA的3，NA）。准备在二甲基亚砜（DMSO）0.1 M的股票SA 3适用的解决方案，并立即使用或储存于-20°C准备6毫升工作方案/微孔板稀释股票SA 3适用的解决方案在TBS的1/100的。
- 考马斯蓝：准备一个股票的10％考马斯亮蓝R-250（考马斯蓝）在TBS的解决方案，并使用立即或贮存于-20°C准备6毫升工作的解决方案，通过在TBS稀释原液1/1000。
2。准备唾液
3。微孔板设置
- 标本：每个测试，加入终体积为150μL/孔20μL唾液。没有引入气泡移液混合。
- 控制：阳性对照包含个人防护装备，但没有唾液。阴性对照组中含有唾液，但没有PPE.To阳性对照，以及添加20μL的TBS电视台。到负的控制，以及添加20μL的唾液。
- PPE的孵育：摇个人防护装备工作的解决方案。加入50μL的个人防护装备工作的解决方案，以每口井不包括阴性对照井。阴性对照井，添加50μL的TBS电视台。在23°C孵育10分钟
- 底物孵育：3 SA的50μL，无工作的解决方案，以每口井。在23°C孵育45分钟
- 考马斯蓝：50μL考马斯蓝工作液添加</ LI>
- READ-酶标仪读取吸光度，405纳米检测SA的3无乳沟代表积极α1 PI和一个595 nm的检测考马斯亮蓝蛋白质含量。
4。计算α1的PI指数
- 正常化的平均405 nm 和 595 nm处 ：对于每个一式三份，计算平均值。从样本平均减去负控制平均水平。为了最大限度地减少板对板的变化，规范的平均值除以平均每个标本阳性对照平均如下：
- 计算α1有价证券INEX：除以归归一个595纳米405纳米 ：
5。代表结果
以确定是否α测试可能适合使用作为保健点的筛选试验，监测CD4细胞计数在地方病，资源有限的地区，刺激唾液收集了20位女性和11位男性的HIV-1受试者参加诊所在喀麦隆的日常护理。与α测试使用唾液收集在纽约市的发展过程中的初步意见是一致的，在喀麦隆与CD4细胞计数（R 2 = 0.91，P <0.0001，N = 31）相关的α1 PI指数在唾液收集。关系的定义是由3个参数的S形曲线，具有剂量-反应关系（图2A）是一致的。 95％的信心和预测区间描绘蓝色和红色的线，分别为（图2B）。
在先前的研究中，我们确定的CD4 + T细胞表现出正弦循环周期23±3.5天在HIV-1科目，并在继承的版本与α1有价证券投资不足（PIZZ）3科目。此处所描述的是一个计算机生成的正弦曲线分析骑自行车在非HIV-1健康展出27天的周期（图3A）控制的CD4代表性的例子。
计算机生成的正弦曲线分析的CD4 + T细胞的变化，在6个科目取得了峰-峰幅度和振荡3轴的值。正如所预料的，振荡轴与振幅（R 2 = 0.96，P = 0.009，N = 6）（ 图3B）。在患者低的CD4 T细胞计数，CD4 + T细胞计数的周期性变化较小，在高CD4 + T细胞计数的患者，周期性变化大。
因为在图2所示的回归线估计振荡和振荡轴的轴与振幅，振幅可以计算的回归，从而估计多远的上方和下方的回归线CD4 + T细胞，将有望因自行车（ 图3C）。叠加图3c和图2B计算置信区间的幅度计算，人们发现，在于95％的幅度（绿线）内的置信区间（蓝线）（ 图3D）。
图1。程序简介：口广场柠檬酸和收集唾液。新增摊薄唾液微孔板一式三份的水井。新增个人防护装备，以每口井，并在23°C孵育15分钟添加PPE基板每口井，并在23°C孵育45分钟。加入考马斯亮蓝和读取在405 nm检测个人防护装备的活动，并在595 nm处检测蛋白。
图2。 α测试比较标准的CD4枚举法。一）α测试是由定量刺激的全口唾液中的α1 PI指数。医疗使用标准的流式细胞仪由一个独立的实验室进行CD4细胞计数。流式细胞仪和唾液，血液被收集在同一诊。由三参数S形曲线（R 2 = 0.91，P <0.0001，N = 31），B）95％的信心和预测区间在蓝色和红色描绘的α1 PI指数和CD4细胞计数之间的关系被定义线，分别。
图3。精度计算的CD4Ç使用的α1PIIndex.A的ounts）的CD4 + T细胞具有非HIV-1健康控制在27天周期的正弦循环。描绘振荡轴（红色虚线）B）计算机生成的CD4 T细胞循环4 HIV-1的科目是用来计算的峰-峰值的幅度和振荡轴，非HIV-1的正弦波分析-1 PIzz主体，非HIV-1健康对照A部分描述的CD4之间的关系的T +细胞的幅度和振荡轴的定义是由3个参数的S形曲线（R 2 = 0.96，P = 0.009，N = 6），C）B部分）的振荡幅度和轴之间的S形关系被用来计算预期的振幅沿回归线（黑线）从图2点（绿线）D）预期幅度间隔（绿线）从95％置信区间显着差异（蓝线）曼惠特尼秩和检验（中位数95％的置信区间和回归线（63细胞/μL之间的差异比较基础）之间的振幅线，回归线（37细胞中位数差异决定/μL），P = 0.001）。
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Discussion
未稀释的血清中含有的中位数为36μM的α1 PI和3.6微米α2巨球蛋白（α2米 ），10倍的差异8。这两种蛋白质的竞争结合个人防护装备。利用这两个特点，浓度和个人防护装备的亲和力，已发展出一种方法，是专门测量在正常血清中存在竞争α2米 8的α1有价证券。这种方法可以在0.3％血清检测低至50纳米μ1有价证券。在血清稀释度为2.5％，α2米个人防护装备的结合成为不到，这种稀释包含约900纳米α1 PI和90纳米α2 M。
相比之下血清组成的10倍以上，α1的PI比α2米 ，整个口腔唾液中含有20倍的差距9。我们在目前的研究发现，稀释，刺激唾液包含约30倍的α1比血清或约1200纳米α1有价证券有价证券，预计将包含约60 nm的α2 M。 α测试的最佳唾液稀释被认为是13％，刺激唾液，稀释预计将包含约160纳米α1 PI和8 nm的α2米，2米 α浓度低于阈值在协议的检测。由于低浓度的α2米 ，它是可以准确地确定唾液中的α1有价证券的具体活动不关心从α2研究的竞争活性α1 PI和唾液中蛋白质含量的测量允许的α1 PI指数，该产品被发现关联与CD4细胞计数，流式细胞仪测量的标准方法计算。重要的是，回归分析的结果（R CD4枚举方法以前没有考虑到的变化，是由于循环。在实际应用中，CD4细胞计数可以由多达200个细胞/μL的最低点和顶点之间的23-27天的周期变化，这是正确的方法测量CD4 + T细胞3。因此，正弦波振荡轴提供了一个更准确的测量一个人的真正的CD4 + T细胞计数比单一天的措施，因为振荡轴是不变小时小时，每个星期。虽然它可能是不可行的直接衡量一个人的CD4 + T细胞的振荡轴，这可以在CD4细胞计数平均纵向CD4 + T细胞计数作为变化只要不超过预期的幅度估计。大变化在CD4细胞计数的s就表示比骑自行车以外的其他变量的影响。 回归线图2所示是一个振荡轴的估计。回归直线的上方和下方的预期幅度的计算结果表明，幅度在95％置信区间。中位数95％的置信区间和回归线之间的区别是63 CD4细胞/μL，幅度和回归线之间的区别是中位数37 CD4细胞/微升。这可以解释为，95％的CD4计数从α测试测量计算，将在约63实际的CD4计数CD4细胞/微升，而这种差异约58％是由于向CD4循环。因此，α测试精度的置信区间和幅度，这是约26 CD4细胞/μL之间的距离，α测试的准确性是相关coefficieNT是0.95或95％的回归线。 本文所述的α测试有许多限制，但都是现成的解决方案。例如，即使α-试验使用的微孔板格式，能够执行的α测试，使用单一的唾液稀释允许使用α测试试纸技术，仪器，技术简单的系统。约2％，在喀麦隆收集唾液样本操作过于粘稠，唾液收集在纽约市，这是一致的。这些样本的DNase的应用可用于改善粘度，从而允许测量10。另外一个解决方案可能是使用药物的sialagogues，特别是通过副交感神经与交感神经通路，从而产生水汪汪的唾液刺激唾液分泌。这样一个催涎剂是罗卡11。最后，α测试有没有ţ尚未得到证实，这是必要的，以确定性能是否有足够的歧视性的CD4细胞计数的临界水平12。 CD4细胞计数的临界水平，在允许这些值计算线性算法的S型回归曲线的线性区域。在这一人群中，线性回归值小于860的CD4细胞/μL（R 2 = 0.86，N = 30，P <2X10 -7）S形回归（R 2 = 0.88，N = 30，P < 0.0001）。线性回归，为α1的PI指数高于67，这 相当于约350 CD4细胞/μL（R 2 = 0.88，N = 15，P = 0.002）的S形回归（R 2 = 0.89，N = 15的好P <0.0001）。然而，相关α1有价证券指数低于67，这 相当于<350的CD4明显的细胞/μL（R 2 = 0.17，P = 0.54，N = 15）。这是因为W的临界值何指引建议CD4细胞计数<350 CD4细胞/μL资格获得抗逆转录病毒治疗13。为了更好地确定α测试的性能，并改善在较低值的敏感性，一个额外的800唾液样本正在收集4组喀麦隆：新生儿的2岁，3-5岁和6-15岁和16岁以上。 α测试的结论，是生理有关的血液中的CD4细胞数量，还可以使用唾液，从而提供了一种无创，准确和精确的点保健监测CD4细胞计数在流行地区，在没有仪器的方法成本每不到一美元的测试。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
研究是由哈利·温斯顿研究基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
References
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