Summary
Een opsomming CD4 methode de α-test wordt beschreven waarbij gebruik geheel speeksel snelle en accurate CD4-tellingen. De α-test kost centen en elimineert de behoefte aan technische opleidingen, dure reagentia zoals monoklonale antilichamen, instrumentatie, koeling, het vervoer van monsters, maar ook het verzamelen en behandelen van bloed.
Abstract
Er is dringend behoefte aan betaalbare CD4-telling aan HIV-ziekte te controleren. CD4-telling buiten bereik is in gebieden met beperkte middelen de regio's als gevolg van de tijd en temperatuur beperkingen, technische verfijning, en de kosten van reagentia, in het bijzonder monoklonale antilichamen tegen CD4 op bloedcellen, de enige op dit moment aanvaardbare methode te meten. Een veelgebruikt kostenbesparende en tijdbesparende laboratorium strategie is om te berekenen in plaats van maatregel bepaalde bloedwaarden. Bijvoorbeeld, LDL berekend met de gemeten concentraties van totaal cholesterol, HDL en triglyceriden 1. Zo, de identificatie van celvrij correlaten die direct reguleren van het aantal CD4 + T-cellen kan een nauwkeurige methode voor de berekening van CD4 bieden telt als gevolg van de fysiologische relevantie van de correlaten.
Het aantal van stamcellen die bloed in en zijn bestemd om circulerende CD4 + T-cellen bepaald door de chemokine CXCL12 eennd zijn receptor CXCR4 als gevolg van hun invloed op de motoriek 2. Het proces van stamcellen beweging in bloed wordt bovendien geregeld celoppervlak menselijk leukocyt elastase (HLE CS) en HLE CS reactieve actieve α een proteinase inhibitor (α 1 PI, α 1-antitrypsine, SerpinA1) 3. In de HIV-1-en vaatziekten, is α 1 PI geïnactiveerd als gevolg van ziekte-processen 4. In de vroege asymptomatische categorieën HIV-1 ziekte, werd actieve α 1 PI bevonden dan normaal in 100% van de onbehandelde met HIV-1 (mediane = 12 pM en normale te bereiken gedurende de symptomatische type 4, 5. Deze patroon is toegeschreven aan het immuunsysteem inactivering niet voldoende synthese proteolytische inactivering of zuurstof. Waargenomen werd dat in HIV-1 patiënten met> 220 CD4-cellen / ul, CD4 gecorreleerd met serumconcentraties actieve α 1 PI (r 2 = 0,93, p < 0,0001, n = 26) en niet-actieve α 1 PI (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. Toediening van α 1 PI aan HIV-1 geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde patiënten resulteerde in een dramatische toename van CD4-tellingen suggereren α 1 PI neemt deel in het reguleren van het aantal CD4 + T-cellen in het bloed 3.
Met stimulatie, hele speeksel bevat voldoende sereuze exsudaat (plasma met eiwitmateriaal dat door middel van de bloedvatwanden gaat over in speeksel) om het meten van de actieve α 1 PI en de correlatie van deze meting is het bewijs dat het een accurate methode voor de berekening van CD4-tellingen. In het kort, sialogogues zoals kauwgom of citroenzuur stimuleren de afscheiding van serum in hele mond speeksel. Na stimuleren serum exudatie, wordt de activiteit van serum α 1 PI in speeksel gemeten door zijn vermogen om elastase activiteit remmen. Varkens pancreas elastase (PPE)een beschikbaar goedkope bron van elastase. PPE bindt aan een PI α die een-op-een complex PPE voorkomt splitsen zijn specifieke substraten, waarvan de colorimetrische peptide, succinyl-Ala-L-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Incuberen speeksel met een verzadigende concentratie PPE gedurende 10 min bij kamertemperatuur kan de binding van PPE alle actieve α 1 PI in speeksel. De resulterende remming van PPE door actieve α 1 PI kan worden gemeten door de PPE substraat SA 3 NA. (Figuur 1). Hoewel CD4 gemeten bloedvolume (CD4-cellen / pl), wordt de concentratie van α 1 PI in speeksel betrekking tot de concentratie van serum in speeksel, niet het volume van speeksel sinds deel aanzienlijk kan variëren overdag persoon tot persoon 6. Echter vrijwel alle eiwit in speeksel door serum inhoud en het eiwitgehalte van speeksel measurable 7. Zo wordt actief α 1 PI in het speeksel berekend als een percentage van het speeksel eiwitgehalte en wordt aangeduid als de α 1 PI Index. De resultaten die hierin aan te tonen dat de α 1 PI Index een accurate en nauwkeurige fysiologische methode voor de berekening van CD4-tellingen biedt.
Protocol
1. Bereid verse Werken Solutions
- TBS: 0,05 M Tris gebufferde zoutoplossing, pH 7,8 (TBS). Bereid 60 ml TBS / microplaat.
- PPE: Varkens pancreas elastase, type 1 (PPE) wordt geleverd als een suspensie. Goed schudden en verdunnen PPE in TBS tot ongeveer 0,01 U / ml. Bereid 6 ml werkoplossing / microplaat).
- SA 3 NA: succinyl-Ala-L-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Bereid 0,1 M voorraad SA 3 NA oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) en onmiddellijk gebruiken of bewaren bij -20 ° C. Bereid 6 ml werkende oplossing / microplaat door het verdunnen van voorraad SA 3 NA oplossing 1/100 in TBS.
- Coomassie Blue: Maak een voorraad oplossing van 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Blue) in TBS en direct of op te slaan bij -20 ° C te gebruiken Bereid 6 ml werkoplossing door het verdunnen van stockoplossing 1/1000 in TBS.
2. Bereid Speeksel
3. Microplate Set-up
- MODELLEN: Voor elke proef goed wordt 20 uL speeksel een eindvolume van 150 ul / well. Meng door pipetteren zonder dat er bubbels.
- Controles: de positieve controle bevat PPE, maar geen speeksel. De negatieve controle bevat het speeksel, maar geen PPE.To de positieve controle en wordt toegevoegd 20 ul TBS. Om de negatieve controle goed wordt toegevoegd 20 ul speeksel.
- PPE Incubatie: Shake PPE werkende oplossing goed. Voeg 50 uL PPE werkende oplossing in elk putje met uitzondering van de putjes voor negatieve controle. Om de putjes voor negatieve controle, voeg 50 ul TBS. Incubeer 10 min bij 23 ° C.
- ONDERGROND Incubatie: Voeg 50 uL SA 3 NA werkende oplossing in elk putje. Incubeer 45 min bij 23 ° C.
- Coomassie blauw:. Voeg 50 uL Coomassie Blue werkende oplossing </ Li>
- LEES-OUT: Lees absorptie in microplaat lezer, een golflengte van 405 nm tot SA 3 NA kloof die actief α 1 PI en A 595 nm tot Coomassie Blue welk eiwit gehalte is te detecteren is op te sporen.
4. Bereken α 1 PI Index
- Normaliseren gemiddeld een 405 nm en 595 nm A: Voor elke drievoud, berekenen het gemiddelde. Trek de negatieve controle gemiddelde van de Specimen gemiddelde. Om plate-to-plate variatie te minimaliseren, normaliseren de gemiddelden door deling van elk exemplaar gemiddelde van de positieve controle gemiddelde als volgt:
- BEREKEN DE α 1 PI INEX: Verdeel de genormaliseerde A 405 nm door de genormaliseerde A 595 nm:
5. Representatieve resultaten
Om te bepalen of de α-test geschikt zouden kunnen zijn voor gebruik als een point-of-care test om CD4-tellingen in endemisch zijn, met beperkte middelen de regio's te controleren, werd gestimuleerd speeksel verzameld uit 20 vrouwelijke en 11 mannelijke HIV-1 patiënten aanwezig kliniek voor routinematige zorg in Kameroen. In overeenstemming met inleidende opmerkingen tijdens de ontwikkeling van de α-test met speeksel verzameld in New York City, de α 1 PI Index in het speeksel verzameld in Kameroen gecorreleerd met CD4-tellingen (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). De relatie werd bepaald door een 3-parameter sigmoïdale curve die in overeenstemming is met een dosis-respons relatie (Figuur 2A). De 95%-betrouwbaarheidsinterval en de voorspelling intervallen worden afgebeeld met blauwe en rode lijnen respectievelijk (Figuur 2B).
Ineen eerder onderzoek hebben we vastgesteld dat CD4 + T-cellen sinusvormige fietsen met periodiciteit 23 ± 3,5 dag in HIV-1 proefpersonen en bij patiënten met de erfelijke versie van α 1 PI-deficiëntie (Pizz) 3 vertonen. Afgebeeld hierin is een representatief voorbeeld van computer-gegenereerde sinus curve analyse van CD4 fietsen in een niet-HIV-1 gezonde controlepersonen vertonen 27 dagen periodiciteit (Figuur 3A).
Computer gegenereerde sinus analyse van de CD4 + T-cel veranderingen in 6 patiënten leverde waarden piek-piek amplitude en slingeras 3. Zoals verwacht, is de slingeras gecorreleerd met amplitude (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (Figuur 3B). Bij patiënten zullen lage CD4 T + cellen, de cyclische veranderingen in de CD4 T-cellen waren klein, en bij patiënten met een hoog CD4 + T cellen, cyclische veranderingen waren groot.
Omdat deregressielijn in figuur 2 weergegeven schat de slingeras en de slingeras is gecorreleerd met amplitude amplitude kan worden berekend voor de regressielijn waardoor raming van ver boven en onder de regressielijn CD4 + T-cellen zouden worden verwacht verschillen door de fietsen (Figuur 3C). Die over de amplitude berekend figuur 3C en betrouwbaarheidsinterval berekend in figuur 2B, is gebleken dat amplitude (groen) ligt binnen 95% van de betrouwbaarheidsinterval (blauw) (figuur 3d).
Figuur 1. Procedure Samenvatting: Plaats citroenzuur in de mond en het verzamelen van speeksel. Voeg verdunde speeksel aan putjes van een microtiterplaat in drievoud. Voeg PPE in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij 23 ° C. Voeg de PPE substraat in elk putje en gedurende 45 min geïncubeerd bij 23 ° C. Voeg Coomassie Blue en bij 405 nm EPI te detecteren en 595 nm te eiwit te detecteren.
Figuur 2. Vergelijking van de α-test met de standaard CD4 opsomming methode. A) Het α-test werd uitgevoerd door het kwantificeren α 1 PI Index in gestimuleerde hele mond speeksel. CD4-tellingen werden uitgevoerd door een onafhankelijk medisch laboratorium met behulp van standaard flowcytometrie. Bloed voor flowcytometrie en speeksel werden verzameld op hetzelfde bezoek aan de kliniek. De relatie tussen de α 1 PI-index en CD4-tellingen werd gedefinieerd door een 3-parameter sigmoïdale curve (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) De 95%-betrouwbaarheidsinterval en de voorspelling intervallen zijn weergegeven in blauw en rood lijnen.
Figuur 3. Nauwkeurigheid van de berekening van de CD4-counts met de α1PI Index.A) CD4 + T-cellen vertoonde sinusvormige fietsen met 27 dagen periodiciteit in een niet-HIV-1 gezonde controle. De slingeras afgebeeld (rode stippellijn). B) Computer sinusgolf analyse van CD4 T-cel cycli werden gebruikt om de piek-piek amplitude en slingeras berekenen 4 HIV-1 personen een niet-HIV -1 Pizz onderworpen, en de niet-HIV-1 gezonde afgebeeld in deel A. De relatie tussen CD4 T-cellen amplitude en slingeras werd bepaald door drie-parameter sigmoïdale curve (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) De sigmoïdale verhouding tussen amplitude en slingeras gedeeltelijk afgeleid B) werd gebruikt om de verwachte amplitude (groene lijnen) van punten langs de regressielijn (zwarte lijn) uit Figuur 2 berekenen. D) de verwachte amplitude interval (groene lijnen) was significant verschillend van de 95%-betrouwbaarheidsinterval (blauwe lijnen), zoals bepaald door de Mann Whitney Rank Sum Test (gebaseerd op een vergelijking van de gemiddelde verschil tussen de 95%-betrouwbaarheidsinterval en de regressielijn (63 cellen / ul) en de gemiddelde verschil tussen de amplitude lijn en regressielijn (37 cellen / ul), p = 0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onverdund serum bevat mediaan 36 uM α 1 PI en 3,6 uM α 2 macroglobuline (α 2 M) een 10-voudig verschil 8. Beide eiwitten concurreren voor binding aan PPE. Deze twee karakteristieken, concentratie en PPE affiniteit zijn gebruikt om een methode die kan specifiek gemeten α 1 PI in normale serum in de aanwezigheid van concurrerende α 2 M 8 ontwikkelen. Deze methode kan detecteren slechts 50 nM μ een PI 0,3% serum. Bij een serum verdunning van 2,5%, de binding van α 2 M de beschermingsmiddelen wordt niet op te sporen, en deze verdunning bevat ongeveer 900 nm α een PI en 90 nM α 2 M.
In tegenstelling tot serum dat bestaat uit 10 maal α 1 PI dan α 2 M, geheel mond speeksel 20-voudig verschil 9 bevat. We vonden in de huidige studie dat onverdund, gestimuleerd speekselbevat ongeveer 30 maal lager α 1 PI dan serum of ongeveer 1200 nM α 1 PI en zou naar verwachting tot ongeveer 60 nM α 2 M. bevatten De optimale verdunning van het speeksel α-test werd gevonden 13% speeksel, en deze verdunning wordt verwacht dat ongeveer 160 nM bevatten α 1 PI en 8 nm α 2 M, een concentratie van α 2 M dat onder de drempel van detectie in het protocol. Door de lage concentratie van α 2 M, is het mogelijk om de specifieke activiteit van α 1 PI in speeksel nauwkeurig bepalen zonder gevaar voor concurrentie van α 2 M. Metingen van actieve α 1 PI en eiwitgehalte in speeksel mogelijk de berekening van de α 1 PI Index die correleerde met de standaard methode voor het meten CD4, flowcytometrie. Belangrijk is dat de resultaten van regressieanalyse (r CD4 opsomming methoden zijn niet eerder rekening gehouden met de variatie die het gevolg is van fietsen. In de praktijk kan CD4-tellingen variëren met maar liefst 200 cellen / ul tussen de nadir en top met een frequentie van 23-27 dagen, en dit geldt ongeacht de methode voor het meten van CD4 + T-cellen 3. Zo is de sinus-as van de trilling zorgt voor een meer nauwkeurige meting van het ware een individu CD4 + T-cellen dan de maatregel een dag, omdat de as van de trilling is constant van uur tot uur, week tot week. Hoewel het niet mogelijk om de slingeras rechtstreeks meten van een individu CD4 + T-cellen kan dit worden gedaan door een gemiddeld longitudinale CD4 + T-cellen zolang variatie in CD4 niet overschrijdt verwachte amplitude. Grote variaties in CD4-tellingen zou wijzen op de invloed van andere variabelen dan fietsen. De regressielijn afgebeeld in figuur 2 is een schatting van de as van de trilling. Berekening van de verwachte amplitude boven en onder de regressielijn bleek dat amplitude ligt binnen de 95%-betrouwbaarheidsinterval. De gemiddelde verschil tussen de 95%-betrouwbaarheidsinterval en de regressielijn is 63 CD4-cellen / ul, en de mediane verschil tussen amplitude en de regressielijn is 37 CD4 cellen / ul. Dit kan uitgelegd dat 95% van de CD4 berekend uit de α-test metingen binnen ongeveer 63 CD4-cellen / ul van de werkelijke CD4 en ongeveer 58% van dit verschil wordt door CD4 fietsen. Aldus is de nauwkeurigheid van de α-test is de afstand tussen de betrouwbaarheidsinterval en amplitude die ongeveer 26 CD4-cellen / ul en de nauwkeurigheid van de α-test is de correlatie coefficient van de regressielijn die 0,95 of 95%. Er zijn verschillende beperkingen aan de α-test zoals hierin beschreven, maar oplossingen zijn beschikbaar. Bijvoorbeeld, hoewel de beschreven α microplaat-test een indeling wordt de mogelijkheid om de α-test met een speeksel verdunning voeren kan de α-test wordt gebruikt dipstick technologie instrument vrij, technologisch eenvoudig systeem. Ongeveer 2% van het speeksel afgenomen in Kameroen waren te viskeus te manipuleren, en dit in overeenstemming is met speeksel verzameld in New York City. De toepassing van DNase tot deze monsters kunnen worden gebruikt om zodoende de viscositeit gemeten 10 verbeteren. Een bijkomende oplossing zou kunnen zijn farmacologische sialagogues die specifiek speeksel secretie te stimuleren via de parasympathische versus sympathieke weg waardoor de productie van waterig speeksel te gebruiken. Een dergelijke sialagogue is pilocarpine 11. Ten slotte α-test geent nog niet gevalideerd, en dat is nodig om te bepalen of de prestaties voldoende discriminerend voor kritische niveaus van CD4-tellingen 12. De kritische niveaus van CD4-tellingen zijn in het lineaire gebied van de sigmoïdale regressie curve waardoor deze waarden worden berekend door een lineaire algoritme. In deze populatie, de lineaire regressie waarden <860 CD4-cellen / ul (R2 = 0,86, n = 30, p <2x10 -7) zo goed als de sigmoïdale regressie (r 2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). De lineaire regressie α 1 PI indices boven 67 die overeenkomt met ongeveer 350 CD4-cellen / ul (2 r = 0,88, n = 15, p = 0,002) zo goed als de sigmoïdale regressie (r 2 = 0,89, n = 15, p <0,0001). Maar correlatie niet significant bij α 1 PI Indices lager 67 die overeenkomt met <350 CD4-cellen / ul (R2 = 0,17 p = 0,54, n = 15). Dit is een kritische waarde, omdat WHO richtlijnen bevelen een CD4 aantal <350 CD4 cellen / ul aanmerking te komen voor de toegang tot antiretrovirale therapie 13. Om beter bepalen de prestaties van de α-test en verbeteren van de gevoeligheid bij lagere waarden wordt een extra 800 speeksel werd verzameld in Kameroen van vier groepen: pasgeborenen-2 jaar, 3-5 jaar en 6-15 jaar en 16 jaar en ouder. Kortom, de α-test fysiologisch relevante het aantal van CD4-cellen in het bloed maar kan worden uitgevoerd met speeksel waardoor een niet-invasieve, nauwkeurige en juiste punt-of-care methode voor het bewaken CD4 in endemisch zonder instrumenten in een kosten-per-test die is minder dan een dollar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het onderzoek werd ondersteund door de Harry Winston Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
References
- Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
- Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
- Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
- Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
- Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
- de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
- Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
- Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
- Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
- LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
- Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
- WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).
