Summary
우리는 뉴런이나 폴리에틸렌 흡입 피펫을 사용하여 모든의 연결을 요로에 형광등과 칼슘에 민감한 염료의 높은 농도를 도입을위한 간단하고 저렴한 비용으로 기술을 설명합니다.
Abstract
뉴런의 역행 라벨은 또한 뉴런 3-6 칼슘 및 전압에 민감한 염료를로드하는 데 사용되었습니다 표준 해부 방법 1,2입니다. 일반적으로 염료는 고체 크리스털이나 유리 pipettes를 사용하여 로컬 압력 주입에 의해 적용됩니다. 그러나 이것은 몇 시간이 염료 확산이 필요합니다 특히 때 염료 및 감소 라벨 강도의 희석이 발생할 수 있습니다. 여기 염료 용액으로 가득 폴리에틸렌 흡입 피펫을 사용하여 뉴런으로 형광등 및 이온에 민감한 염료를 도입을위한 간단하고 저비 용의 기술을 보여줍니다. 이 방법은 로딩 과정 전반에 걸쳐 axons과 접촉 염료의 높은 농도를 유지하는 안정적인 방법을 제공합니다.
Protocol
형광등 dextrans은 해부 학적 도구로 및 이미징의 연결 활동 1-4 위해 사용되었습니다. 필드 외., 2009 년 4 모델 시스템으로 척수에 초점 axonal 책자로 이온 및 전압에 민감한 염료를 적용하기위한 프로토콜을 발표했다. 여기에서-체외 optophysiological 및 형태학의 연구를 위해 컷 복부 뿌리, 지느러미 뿌리 또는 척수의 넓이의 연결로 형광 및 / 또는 이온에 민감한 염료를 적용하기위한 자세한 절차를 설명합니다.
1. 타입 I과 타입 II의 Pipettes
테이퍼 팁과 pipettes를 생성하기 위해 알코올 램프 7 불꽃 위에 폴리에틸렌 튜빙의 두 단편 섹션 (PE90, 클레이 아담스 브랜드)을 벗어서 시작합니다. 한 피펫 (타입 I)은 단단히 대상 루트 또는 넓이를 (:; 내경 0.2-0.4 MM : 0.1-0.3 mm 외경) 저장할 수있는 작은 팁을 함께 (3-7밀리미터) 짧은이어야합니다. 그런 다음 두 번째 피펫 (Type을 끌어-II) 이상 (8~12센티미터) 얇고 축과 아주 좋은 팁 (외경과 : 0.2-0.3 mm, 내경 : 삽입할 수 0.1-0.2 ㎜) 타입 - 난만큼 피펫 그 끝. 두 번째 얇은 피펫은 타입-I 피펫에서 각각 인공 뇌척수 (aCSF)와 염료 솔루션을 대기음하고 소개하는 데 사용됩니다.
2. 의 위치 유형 - 전 피펫
해부 및 척수에게 8,9를 분리하고 로딩 과정 전반에 걸쳐 냉장 aCSF (~ 16 ° C)로 superfused 욕조,에 넣습니다. 타입-I는 다시 오프닝 쉽게 유연한 튜브를 통해 주사기 (1ml U-100 인슐린 주사기, Becton Dickenson 또는 비교)에 연결될 수 있도록 전극 홀더 (H1/12 전극 홀더, Narishige)에 피펫 (PharMed를 배치 BPT, 콜 - Parmer, # AY242002, 10 ㎝) (Fig.1A-B).
3. 염료 신청
- 주사기를 사용하여 먼저 그리기유형 - 전 피펫 (Fig.1B, 2A)로 aCSF은 axonal 요로 또는 (그림 2B) 자필 서명하려면 루트로 따라갔다. 플렉시블 튜브 그런 다음 다시 개통에서 제거되어야합니다. 타입-II 피펫은 다른 주사기에 부착된 및 유형 - 전 axonal 요로 또는 루트 개최 피펫에 삽입됩니다. 그래서 잔여 aCSF 방금 axonal 요로 (; 2C-D Fig.1C)를 포함하는 타입-II 피펫, 기음 aCSF에 부착된 주사기를 사용합니다. 그런 타입-I 피펫에서 타입-II 피펫을 철회. axonal 요로이나 신경 좋은 도장을 확인하기 위해 몇 분 동안 aCSF 수준 ( "좋은 씰"에 대한 문제 해결에 제 3 항 참조) 모니터링합니다.
- aCSF의 색소 또는 더블 증류수에 0.2 % 트리톤 X-100를 해산하고 기포를 포함하지 않도록 신경을 쓰는 동안 타입-II 피펫으로 그것을 그립니다. 유형 - 전 피펫으로하고 잔류 aCSF 솔루션 (그림의 2E)로 염료를 포함하는 타입-II 피펫을 넣습니다. 천천히 풀어부드러운 긍정적인 압력 (그림 2F)를 사용 aCSF에 염료. 모든 공기 방울을 소개하거나 팁 안쪽에서 대상 조직의 변위를 발생하지 않도록주의하십시오. 염료 충분한 양의 (염료 용액 3-5 μL) 출시 이후 타입-II 피펫을 철회.
4. 잠복
실험의 종류에 따라 6-20시간 사이 어둠 속에서 조직을 품어. 일단 충분한 시간 충전에 허용되어 부드럽게 영상이나 조직학을위한 조직 준비 떠난 조직에서 전극을 멀리 당기십시오.
문제 해결
- 대상 조직의 유형 - 내가 피펫의 일각에 쉽게 입력하거나 한 내부 헐거워되지 않으면 다음 팁 직경은 잘못된 크기입니다. 이런 경우 뽑아 다른 피펫을 사용합니다.
- 타입-I 피펫의 aCSF에 염료를 추가하기 전에 충분한 aCSF는 그것에 도달할 수 있도록 남아 있는지 확인타입-II 피펫 팁 (그림 2D). 염료가 추가되면 그렇지 않으면, 에어 갭이 존재합니다. 이런 경우 염료를 추가하고 피펫에서 axonal 요로를 제거한 다음 유형-II 피펫에 의해 도달할 수있는 충분한 aCSF으로 다시 그려하지 않습니다.
- 타입-I 피펫 증가에 aCSF 수준이 그것이 타입-II 피펫으로 aspirated되자면 조직과 인감이 좋지 않다는 것을 의미합니다. 다른 전극을 사용, 그렇지 않으면 염료가 라벨 과정에서 희석됩니다.
- 염료를 주입하면서 공기 방울이 유형 - 전 피펫으로 도입되면, 풍선에 타입-II 피펫 팁 주변을 발전 부드럽게 연결된 주사기를 사용하여 약한 부정적인 압력을 적용하여 거품을 배수.
5. 대표 결과
방법의 응용을 설명하기 위해서, 우리는 동시에로드 motoneurons, 감각 afferents 세 가지 dext와 척수 interneurons형광 염료 (그림 3A) 복합 조사 했어요. 다른 이름으로 그림 그림. 신경 세포의 3B, 세 강좌로 분류되며, 관능 afferents (적색), 복부 삭조 (녹색)과 motoneurons (파란색)으로 돌출 interneurons.
1 그림. 개략도 피펫을 보여주는 타입 I과 타입 II 조립. () 타입 - 나는 그것이 개통이 쉽게 유연한 엘라스토머 튜브 (B)에 연결하고있는로 타입 II 피펫은 (C) 삽입될 수 돌아와요 있도록 피펫 (하늘색)는 전극 홀더에 배치됩니다.
그림 2. 도식은 형광 염료와 motoneurons의 로딩 과정을 보여주고 있습니다. () 타입-I의 피펫은 자필 서명 복부 루트 근처에 위치합니다. (B) 흡입이 루트 다음에 피펫으로 aCSF을 그릴 수있는 피펫에 적용됩니다. (C-D) 종류 - 내가 피펫의 백엔드에서 유연한 엘라스토머 튜브를 분리하고 타입-II 피펫으로 흡입을 적용하여 aCSF의 양을 줄일 수 있습니다. (E) 타입-I 피펫의 나머지 aCSF에 녹아있는 염료를 포함하는 타입-II 피펫의 팁을 넣습니다. (EF) 천천히 염료와 유형 - 전 피펫을 채울 후 타입-II 피펫을 제거합니다.
그림 3. 고립된 마우스 척수로 작성 절차의 응용. () 도식이 보여주는 세 가지 유형 - 전 척수의 연결에서 다른 클래스를 작성하는 데 사용 pipettes.에게 Motoneurons (파란색, 캐스케이드 블루 dextran)와 성례의 감각 afferents (적색, 텍사스 - 빨강 dextran)은 각각 복부와 지느러미 뿌리를 통해 backfilled되었다. 플루오레신 dextran은 누구의 axons 복부 삭조 (VF)를 통해 승천 척추 interneurons를 (녹색)로드하는 데 사용되었습니다. 각 dextran 염료의 1 밀리그램 (10,000 MW, 분자 프로브)6 μL 증류수는 0.2 %를 포함에 녹아되었다 트리톤 X-100 (B). 라벨 감각 afferents 몇 contralateral 전망과 주로 ipsilateral 것을 A. 노트에 설명된대로 뉴런은 백 라벨이 붙지만하는 척수의 성례의 코드에서 섹션 공촛점 이미지입니다. 표시된 interneurons는 채우기의 측면 (화살표 머리)에 contralateral 반면 표시된 motoneurons이 가득한 복부 루트에 ipsilateral 있습니다. 200 μm의 보정 바.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J.
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
