Summary
我们描述了一个简单和低成本的技术引入神经元或神经束，使用聚乙烯吸吸管荧光灯和钙敏感染料的高浓度。
Abstract
逆行标记神经元，是一个标准的解剖方法1,2，也被用来加载到3-6神经元钙和电压敏感染料。一般来说，染料应用于固态晶体或局部压力注射用玻璃吸管。但是，这可能导致稀释染料和减少标签的强度，尤其是当几个小时的染料扩散。在这里，我们展示了一个简单和低成本的技术引入使用聚乙烯吸吸管，充满了染料溶液的神经元的荧光灯和离子敏感的染料。这种方法提供了可靠的方式维持在整个装载过程中的轴突接触高浓度的染料。
Protocol
荧光葡聚糖已被用作解剖工具和成像神经元活动1-4。领域等 。（2009）发表了一份协议，为应用重点是作为一个模型系统的脊髓轴突束离子和电压敏感染料。在这里，我们描述了荧光和/或离子敏感的染料， 在体外 optophysiological和形态学研究申请截止前根，背根或脊髓神经束更详细的过程。
1。 I型和II型移液器
开始拉了一个酒精灯的火焰7两个短节的聚乙烯管材（PE90，粘土亚当斯品牌）生产圆锥提示移液器。一个吸管（I型），应该是一个小技巧，可以紧紧握住目标根或道（外径：0.2-0.4毫米，内直径0.1-0.3毫米）短（3-7毫米）。然后拉第二移液器（类型-Ⅱ）与I型吸取尽可能较长（8-12厘米）的薄，轴和一个非常精尖（外径：0.2-0.3毫米，内径：0.1-0.2毫米），可以插入其尖端。第二更薄移液器将用于人工脑脊液（ACSF）和染料溶液从I型吸管分别吸和介绍。
2。定位型我吸取
解剖和分离脊髓8,9和它放置在整个加载过程与，冰鲜学联（〜16°C）的灌流洗澡，。放置I型电极支架（H1/12电极支架，Narishige）吸取其背面的开口，这样可以很容易地通过软管连接到一个注射器（1毫升的U-100胰岛素注射器，流式细胞迪肯森或类似）（PharMed BPT的，科尔-帕默，AY242002; 10厘米）（ 图1A）。
3。染料中的应用
- 使用注射器，先画进入I型吸管（图1B，2A）学联其次填补（ 图2B）轴突束或根。软管，然后应该从背面的开口。 II型移液器连接到另一个注射器，并插入到I型吸取轴突束或根。因此，剩余的脑脊液只涵盖轴突道（ 图1c; 2C - D）II型移液器，吸学联的注射器的使用。然后退出I型吸管II型移液器。监视了几分钟，确认密封良好，轴突束或神经脑脊液水平（见第3节，在“良好的密封故障排除”）。
- 溶解在学联的染料或双蒸水0.2％的Triton X-100的II型吸管吸引到它，同时注意不包括气泡。插入II型移液器含有染料，分为I型吸管到剩余学联解决方案（ 图2E）。慢慢释放染料进入脑脊液，使用温和的正压力（ 图2F）。要小心不要引入任何气泡或导致靶组织内尖端的位移。撤出后，足量的染料已被释放（3-5μL染料溶液）II型移液器。
4。孵化
该组织在6至20小时，根据实验类型之间的暗孵育。一旦有足够的时间已经允许灌装，轻轻拉离离开组织成像或组织学准备组织电极。
故障排除
- 如果组织的目标并不容易进入到I型吸管尖或松动一旦进入，然后头直径大小是错误的。如果发生这种情况，拉，并使用不同的吸管。
- I型吸管脑脊液前加入染料，确保足够的脑脊液仍然如此，它可以达到II型吸头（ 图2D）。否则，气隙存在，一旦染料中添加。如果发生这种情况，不添加染料和删除从移液器的轴突束，然后绘制它与II型移液器达到足够的脑脊液。
- 如果在I型吸管增加学联水平后，这是与II型吸管吸气，这意味着该组织的密封不好。使用不同的电极，染料，否则将在标注过程中稀释。
- 如果气泡被引入到I型吸管，同时注入染料，推进II型枪头接近泡沫，轻轻地运用弱的负压力，使用所附的注射器，排出气泡。
5。代表结果
为了说明该方法的应用，我们同时加载的运动神经元，感觉传入脊髓的interneurons有三个不同的DEXT跑了共轭荧光染料（ 图3A）。正如图所示。被标记为3B，3类神经元;感觉传入（红色），投射到腹侧索（绿色）和运动神经元（蓝色）的interneurons。
图1。示意图显示移液器I型和II型装配 。 （一）一个类型，我移液器（淡蓝色）是1电极支架放置，以便它的背面的柔性橡胶管（二）开幕式可以很容易地连接和融入其中1 II型吸管可以被插入（三）。
图2。示意图显示的荧光染料的运动神经元的加载过程 。 （A）型我吸管放在附近的腹侧根被填补。 （二）移液器学联绘制根吸管，吸力。 （C四）灵活的橡胶管断开I型吸管后端和应用II型吸管吸去学联金额减少。 （五）II型分为I型吸管其余脑脊液中含有溶解染料的吸管插入尖。 （英法）与染料慢慢地填写I型吸管，然后取出-Ⅱ型吸管。
图3。小鼠离体脊髓灌装过程中的应用 。 （一）示意图显示了三个I型吸液管，用于填补在不同的脊髓神经元类。运动神经元（蓝色;梯级蓝葡聚糖）和骶感觉传入（红色;德州红葡聚糖）分别通过腹和背根，回填。荧光葡聚糖用于装载脊髓的interneurons（绿色），其轴突通过腹侧索（VF）的提升。 1毫克的每个葡聚糖染料（10,000兆瓦;分子探针）被溶解在6μL蒸馏水含有0.2％的Triton X-100（二）。从脊髓中的神经元都回标记A.注意标记的感觉传入，主要与同侧几对侧预测，骶脊髓节共聚焦图像。标记的运动神经元是同侧的填腹根，而标记的interneurons对侧侧填充（箭头）。校准栏200微米。
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Discussion
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Acknowledgments
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