Summary
Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Einführen hohe Konzentration von fluoreszierenden und Calcium-sensitiven Farbstoffen in Neuronen oder neuronaler ein Polyethylen Saugpipette.
Abstract
Retrograde Markierung von Neuronen ist ein Standard anatomische Methode, die auch 1,2 verwendet wurde, um Calcium und spannungsabhängigen Farbstoffen in Neuronen 3-6 geladen. Im Allgemeinen werden die Farbstoffe als feste Kristalle oder durch lokale Injektion mit Druck Glaspipetten aufgebracht. Dies kann jedoch zu einer Verdünnung des Farbstoffs und vermindertem Markierungsintensität führen, insbesondere wenn mehrere Stunden Farbstoffdiffusion erforderlich sind. Hier zeigen wir eine einfache und kostengünstige Technik zur Einführung fluoreszierenden und Ionen-sensitiven Farbstoffen in Neuronen ein Polyethylen Saugpipette mit dem Farbstoff-Lösung gefüllt. Dieses Verfahren bietet eine zuverlässige Möglichkeit zur Aufrechterhaltung einer hohen Konzentration des Farbstoffs in Kontakt mit Axone in der Ladevorgang.
Protocol
Fluoreszierende Dextrane wurden als anatomische Werkzeuge und für die Bildgebung neuronaler Aktivität 4.1 verwendet wurde. Fields et al., (2009) 4 veröffentlichte ein Protokoll für die Anwendung von Ionen-und spannungsabhängigen Farbstoffen zu axonalen Bahnen mit einem Fokus auf das Rückenmark als Modellsystem. Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren für die Anwendung fluoreszierender und / oder Ionen-sensitiven Farbstoffs an den Schnittflächen ventralen Wurzeln, dorsalen Wurzeln oder neuronaler des Rückenmarks für in-vitro optophysiological und morphologischen Untersuchungen.
1. Typ-I-und Typ-II-Pipetten
Starten Sie, indem Sie zwei kurze Abschnitte aus Polyethylen-Schlauch (PE90, Clay Adams Brand) über der Flamme eines Alkohols Lampe 7 bis Pipetten mit verjüngten Spitzen produzieren. Eine Pipette (Typ-I) sollte kurz sein (3-7 mm) mit einer kleinen Spitze, dicht zu halten, kann das Ziel-Root-oder Darm-Trakt (Außendurchmesser: 0,2 bis 0,4 mm; Innendurchmesser: 0,1-0,3 mm). Ziehen Sie dann eine zweite Pipette (Typ-II) mit einer längeren (8-12 cm) dünner, Welle und eine sehr feine Spitze (Aussendurchmesser: 0,2-0,3 mm, Innendurchmesser: 0,1-0,2 mm), die in einsetzbaren die Typ-I pipettieren soweit seine Spitze. Die zweite dünner Pipette verwendet zum Ansaugen und Einführung künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) und Farbstofflösung jeweils von der Typ-I-Pipette werden.
2. Positionierung von Typ-I pipettieren
Sezieren und zu isolieren, die das Rückenmark 8,9 und legen Sie sie in einem Bad, mit gekühltem aCSF (~ 16 ° C) während des Ladevorgangs superfundiert. Platzieren Sie die Typ-I-Pipette auf einem Elektrodenhalter (H1/12 Elektrodenhalter, Narishige), so dass die hintere Öffnung leicht mit einer Spritze (1 ml U-100 Insulin Spritze, Becton Dickinson oder vergleichbaren) werden über einen flexiblen Schlauch verbunden (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (1A-B).
3. Farbauftrag
- Mit Hilfe der Spritze, zuerst ziehenaCSF in den Typ-I-Pipette (1B; 2A), gefolgt von der axonalen-Darm-Trakt oder Wurzel zu besetzen (Abb. 2B) werden. Der flexible Schlauch sollte dann von der hinteren Öffnung entfernt werden. Der Typ-II-Pipette in eine andere Spritze befestigt und in die Typ-I pipettieren Halten des axonalen Trakt oder Wurzel. Mit der Spritze an der Typ-II-Pipette absaugen aCSF, so dass der Rest nur aCSF deckt den axonalen-Darm-Trakt (Abb. 1c; 2C-D). Dann ziehen Sie den Typ-II-Pipette aus der Typ-I-Pipette. Überwachen Sie den aCSF Ebene für ein paar Minuten, um eine gute Abdichtung auf der axonalen-Darm-Trakt oder Nerven zu überprüfen (siehe Abschnitt 3 in Fehlerbehebung für "gute Dichtung").
- Man löst den Farbstoff in aCSF oder 0,2% Triton X-100 in doppelt destilliertem Wasser und ziehen es in die Typ-II-Pipette und achten Sie dabei keine Luftblasen enthalten. Legen Sie die Typ-II-Pipette, die den Farbstoff in den Typ-I-Pipette und in den Überlebensraum aCSF Lösung (Abb. 2E). Langsam loslassender Farbstoff in die aCSF unter leichtem Überdruck (Abb. 2F). Achten Sie darauf, um mögliche Luftblasen einzuführen oder die Verschiebung der Zielgewebe aus dem Inneren der Spitze führen. Entnehmen Sie die Typ-II-Pipette nach einer ausreichenden Menge an Farbstoff wurde veröffentlicht (3-5 ul Farbstofflösung).
4. Incubation
Inkubieren des Gewebes in der Dunkelheit zwischen 6 und 20 Stunden, je nach der Art des Experiments. Sobald genügend Zeit für die Füllung wurde erlaubt, ziehen weg die Elektrode aus dem Gewebe verlassen das Gewebe fertig für die Bildgebung oder Histologie.
Fehlerbehebung
- Wenn das Zielgewebe nicht leicht treten in der Spitze des Typ-I-Pipette oder locker ist einmal drinnen, dann wird der Durchmesser der Spitze hat die falsche Größe. Wenn dies der Fall, ziehen und verwenden Sie eine andere Pipette.
- Vor Zugabe des Farbstoffs an das aCSF in der Typ-I-Pipette, um sicherzustellen, dass genug aCSF so bleibt, dass es mit der erreicht werden kannTyp-II-Pipettenspitze (2D). Andernfalls wird ein Luftspalt vorhanden ist, wenn der Farbstoff zugegeben. Wenn dies der Fall, fügen Sie nicht den Farbstoff und entfernen Sie die axonale-Darm-Trakt aus der Pipette und dann ziehen sie zurück in mit ausreichender aCSF von der Typ-II-Pipette erreicht werden.
- Wenn die aCSF Ebene in den Typ-I-Pipette erhöht, nachdem sie mit dem Typ-II Pipette abgesaugt wurde, bedeutet dies, dass die Dichtung mit dem Gewebe nicht gut ist. Verwenden Sie eine andere Elektrode, da sonst der Farbstoff wird während der Etikettierung Verfahren verdünnt werden.
- Wenn eine Luftblase in die Typ-I-Pipette eingeführt wird während der Injektion des Farbstoffs, die Blase abfließen kann durch Vorschieben des Typ-II-Pipettenspitze in der Nähe der Blase und sanft Anlegen eines schwachen Unterdruck unter Verwendung des beigefügten Spritze.
5. Repräsentative Ergebnisse
Um eine Anwendung der Methode zu veranschaulichen, haben wir gleichzeitig geladen Motoneuronen und sensorischen Afferenzen spinalen Interneuronen mit drei verschiedenen dextlief-konjugierten Fluoreszenzfarbstoffe (3A). Wie in dargestellt. 3B, drei Klassen von Neuronen markiert sind; afferenten Neuronen (rot), Interneuronen, die in das ventrale Funiculus (grün) und Motoneuronen (blau).
Abbildung 1. Schematische Darstellung Pipette Typ-I-und Typ-II-Montage. (A) ein Typ-I Pipette (hellblau) auf einer Elektrode Halter platziert, so dass es wieder ist in Öffnung kann einfach an dem flexiblen Elastomer-Schlauch (B) verbunden werden und in die ein Typ-II-Pipette kann eingesetzt werden (C).
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Ladevorgang von Motoneuronen mit fluoreszierenden Farbstoffen. (A) ein Typ-I-Pipette in der Nähe des ventralen Wurzel zu füllen angeordnet. (B) ist mit dem Saug-Pipette auf aCSF in die Pipette an der Wurzel zu ziehen, gefolgt angewendet. (C-D) Trennen Sie das flexible Elastomer-Schlauch aus dem Backend von Typ-I-Pipette und reduzieren die Menge an aCSF durch Ansaugen des Typ-II-Pipette. (E) Führen Sie die Spitze des Typ-II-Pipette mit dem gelösten Farbstoff in den verbleibenden aCSF in der Typ-I-Pipette. (EF) Langsam füllt sich die Typ-I-Pipette mit dem Farbstoff und entfernen Sie dann den Typ-II-Pipette.
Abbildung 3. Anwendung des Füllvorganges zu dem isolierten Maus-Rückenmark. (A) Schematische Darstellung der drei Typ-I-Pipetten verwendet werden, um die verschiedenen neuronalen Klassen im Rückenmark zu füllen. Motoneuronen (blau; Cascade Blue Dextran) und sakralen sensorischen Afferenzen (rot; Texas-Red Dextran) wurden durch die ventralen und dorsalen Wurzeln verfüllt bzw.. Fluorescein Dextran wurde zur spinalen Interneuronen (grün), deren Axone steigen durch den ventralen Funiculus (VF) zu laden. 1 mg eines jeden Farbstoff Dextran (10.000 MW; Molecular Probes)wurde in 6 ul destilliertem Wasser mit 0,2% gelöst Triton X-100 (B). Konfokale Aufnahme eines Ausschnitts aus dem sakralen Schnur des Rückenmarks, in denen die Neuronen waren zurück-markiert, wie in A. Hinweis beschrieben, dass die markierten sensorischen Afferenzen primär ipsilateral mit ein paar kontralaterale Projektionen sind. Die markierten Motoneuronen sind ipsilateral zur gefüllten ventralen Wurzel, während die kontralaterale markierten Interneuronen an der Seite der Füllung (Pfeilspitze) sind. Kalibrierung bar 200 um.
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Discussion
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Acknowledgments
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