Summary
我々は、ニューロンまたはポリエチレン吸引ピペットを使用して、任意の神経管に蛍光カルシウム感受性色素を高濃度に導入するための簡単かつ低コストの手法を説明します。
Abstract
ニューロンの逆行性標識はまた、ニューロンの3月6日に、カルシウムや電位感受性色素をロードするために使用されている標準的な解剖学的方法1,2です。一般的に、色素が固体結晶として、あるいはガラスピペットを使用してローカルの圧力注入により適用されます。しかし、これはいくつかの時間が染料拡散するために必要な場合は特に、染料と還元の標識強度の希釈になる可能性があります。ここでは、色素溶液を充填したポリエチレン吸引ピペットを用いて神経細胞に蛍光灯やイオン感受性色素を導入するためのシンプルで低コストの手法を示しています。このメソッドは、ロード処理全体の軸索と接触している染料の高濃度を維持するための信頼できる方法を提供しています。
Protocol
蛍光デキストランは、解剖学的ツールとして、イメージング神経活動1-4使用されています。フィールドら 、（2009）4は、モデル系として脊髄を中心とした軸索路にイオンと電位感受性色素を適用するためのプロトコルを公開しました。ここでは、 インビトロ optophysiologicalおよび形態学的研究のためにカット腹根、後根または脊髄のいずれかの神経管に蛍光及び/又はイオン感受性色素を適用するための詳細な手順について説明します。
1。タイプ-IとType-IIピペット
テーパーチップとピペットを生成するためにアルコールランプ7の炎の上にポリエチレンチューブの二つの短いセクション（PE90、クレイ·アダムスブランド）を引いて起動します。 Oneピペット（タイプI）がしっかりとターゲットルートまたは管を（;内径0.2〜0.4ミリメートル：0.1〜0.3ミリメートル外径）を保持できる小型チップで（3-7 mm）を短くする必要があります。次に、第二のピペット（タイプを引く-II）より長い（8-12 cm）の薄型化、シャフトと非常に微細なチップ（外径：0.2〜0.3ミリメートル、内径に挿入することができます0.1〜0.2ミリメートル）タイプ-Iは限りピペットその先端。第二シンナーピペットは、Type-Iピペットからそれぞれ人工脳脊髄液（ACSF）と色素溶液を吸引し、導入するために使用されます。
2。タイプ-Iピペットの位置決め
解剖と脊髄の8,9を分離し、ロード·プロセスを通して冷やしたACSF（〜16°C）で灌流浴に入れてください。タイプ-Iは、そのバックの開口部が容易にフレキシブルチューブを介してシリンジ（1ミリリットルU-100インスリン注射器、ベクトン·ディッキンソンまたは同等の）に接続することができるように電極ホルダー（H1/12電極ホルダー、ナリシゲ）にピペット（PharMedを置くBPT、コール·パーマー、＃AY242002、10センチ）（図1A-B）。
3。染料のアプリケーション
- シリンジを使用して、最初の描画ACSFは、Type-Iにピペット（ 図1B、2A）は満たされるように軸索路またはルート（ 図2B）が続いている。フレキシブルチューブは、その後、開口部から削除する必要があります。タイプ-IIピペットは、別の注射器に接続されているとタイプ-Iは軸索路またはルートホールディングピペットに挿入されます。残留ACSFだけで軸索路（; 2C-D図1C）を覆うようにII型ピペット、吸引ACSFに接続された注射器を使用します。その後I型ピペットからタイプ-IIピペットを取り消すことができます。軸索管や神経（ "良い印鑑"のトラブルシューティングのセクション3を参照）で良好なシールを確認するために数分間ACSFレベルを監視します。
- ACSFの染料または再蒸留水で0.2％トリトンX-100を溶解させ、気泡を含まないように注意を払いながら、タイプ-IIピペットにそれを描画します。 I型ピペットに、残留ACSF溶液（ 図2E）に色素を含有するII型ピペットを挿入します。徐々に放出する穏やかな陽圧（ 図2F）を使用して、ACSFに染料。気泡を導入するか、先端の内側から標的組織の変位を引き起こすことがないように注意してください。染料のに十分な量（染料溶液の3-5μL）がリリースされた後、タイプ-IIピペットを取り消すことができます。
4。インキュベーション
実験の種類に応じて6〜20時間の間に暗闇の中で組織をインキュベートします。一度十分な時間が穏やかにイメージングまたは組織の準備ができて組織を残して組織から電極を引き離し、充填に許可されています。
トラブルシューティング
- 標的組織は、Type-Iピペットの先端に簡単に入力するか、一度内部に緩んでいない場合は、先端径サイズが間違っています。この問題が発生した場合、引き出して、別のピペットを使用しています。
- I型ピペットにACSFに染料を追加する前に、十分なACSFは、それがで到達できるように残っていることを確認してくださいタイプ-IIピペットチップ（ 図2D）。染料が追加されると、それ以外の場合は、エアギャップが存在します。この問題が発生した場合は、染料を追加し、ピペットから軸索路を削除して、Type-IIにピペットで到達するのに十分なACSFでそれを戻って描画されません。
- タイプ-Iピペット増加ACSFのレベルは、それがタイプIIピペットで吸引した後なら、それは組織のシールが良好でないことを意味します。異なる電極を使用して、それ以外の色素が標識手順の中で希釈されます。
- 染料を注入しながら気泡がType-Iピペットに導入されている場合は、バブルにType-IIピペットチップの近くを進めるゆっくりと付属のシリンジを用いて弱い負圧を印加することによって気泡を排出します。
5。代表的な結果
法の適用を説明するために、我々は同時にロード運動ニューロン、感覚求心性、3つの異なるDEXTと脊髄介在蛍光色素（ 図3A）結合を実行しました。 図2に示すように。ニューロンの3B、3つのクラスは、ラベルされています。感覚求心性（赤）、腹索（緑）と運動ニューロン（青）に突出介在。
図1。ピペットタイプ-IとType-IIアセンブリを示す模式図 。 （A）タイプ-Iピペット（ライトブルー）は（C）は背面の開口部が容易に柔軟なエラストマーチューブ（B）に接続することができていると先のType-IIにピペットを挿入することができるように電極ホルダーに配置されます。
図2。蛍光色素とニューロンのロード·プロセスを示す模式図 。 （A）タイプ-Iピペットを充填する前根の近くに配置されています。 （B）吸引は、ルートに続いてピペットにACSFを描画するためのピペットに適用されます。 （C-D）タイプ-Iピペットのバックエンドからの柔軟なエラストマーチューブを外し、タイプ-IIピペットに吸引を適用することにより、ACSFの量を減らすことができます。 （E）タイプ-Iピペット内の残りのACSFに溶解した染料を格納しているType-IIピペットの先端を挿入します。 （EF）を徐々に染料でI型ピペットを記入して、Type-IIにピペットを削除します。
図3。孤立したマウスの脊髄への充填手順の適用 。私はタイプの異なる脊髄神経のクラスを塗りつぶすために使用されるピペット（A）の回路図は、3を示す。運動ニューロン（青、カスケードブルーデキストラン）と仙骨感覚求心性（赤、テキサスレッドデキストラン）をそれぞれ、腹側と背側根を通して埋めた。フルオレセインデキストランは、その軸索は腹索（VF）を介して登る脊髄介在（緑）をロードするために使用された。各デキストラン染料の1ミリグラム（10,000 MW、Molecular Probes社）トリトンX-100（B）0.2％を含む6μLの蒸留水に溶解した。標識された感覚の求心性はいくつかの反対側の突起を有する主に同側であることをAに説明したようにニューロンが戻って標識された脊髄の仙髄からセクションの共焦点画像は、注意してください。標識された介在は、塗りの側（矢印頭部）に反対であるのに対し、ラベルの付いた運動ニューロンは、充填前根と同側である。キャリブレーションバーは200μm。
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Discussion
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Acknowledgments
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