Summary
Biz nöron veya polietilen emme pipet kullanarak herhangi bir nöronal yoluna floresan ve kalsiyum duyarlı boyalar yüksek konsantrasyon tanıtmak için basit ve düşük maliyetli tekniği tanımlandı.
Abstract
Nöronların Retrograd etiketleme de nöronlar 3-6, kalsiyum ve voltaj duyarlı boyalar yüklemek için kullanılan bir standart anatomik yöntemi 1,2. Genel olarak, boyalar katı kristaller halinde ya da cam pipet kullanılarak lokal baskısı enjeksiyon yoluyla uygulanır. Bununla birlikte, bu birkaç saat boya difüzyonu için gerekli olan, özellikle boya ve azaltılmış etiketleme yoğunluğunun seyreltme ile sonuçlanabilir. Burada boya çözeltisi ile doldurulmuş bir polietilen emiş pipet kullanılarak nöronlar içine flüoresan ve iyon karşı hassas boyaların sokulması için basit ve düşük maliyetli bir teknikle göstermektedir. Bu yöntem, yükleme işlemi boyunca akson ile temas halinde boya yüksek bir konsantrasyonunun muhafaza için güvenilir bir yol sunar.
Protocol
Floresan dekstranlar anatomik araçları olarak ve görüntüleme nöronal aktivitenin 1-4 için kullanılmıştır. Alanlar ve ark., (2009) 4 model sistem olarak omurilik odaklanarak aksonal yolları için iyon ve voltaj duyarlı boya uygulamak için bir protokol yayınlamıştır. Burada in-vitro optophysiological ve morfolojik çalışmalar için kesim ventral kök, dorsal kök ve omuriliğin herhangi bir nöronal yollarını floresan ve / veya iyon duyarlı boya uygulamak için daha ayrıntılı bir prosedür tanımlamaktır.
1. Tip I ve Tip-II Pipetler
Sivri uçları olan pipetler üretmek için bir alkol lambası 7 ateşte polietilen boru iki kısa bölümler (PE90, Clay Adams Marka) çekerek başlayın. Bir pipet (Tip-I) sıkıca hedef kök veya sistem (:; İç Çapı 0.2-0.4 mm: 0.1-0.3 mm Dış Çap) tutun küçük bir uç ile (3-7 mm) kısa olmalıdır. Sonra ikinci bir pipet (Tip çekin-II) daha uzun (8-12 cm) ince, şaft ve çok ince bir uç (Dış Çap: 0.2-0.3 mm, iç çapı: eklenebilen 0.1-0.2 mm) Tip-I kadarıyla Pipeti ucu. İkinci ince pipetle Tip I-pipetle sırasıyla yapay serebrospinal akışkan (aCSF) ve boya çözeltisi aspire ve tanıtmak üzere kullanılacaktır.
2. Konumlandırılması Tip-I Pipeti
Inceleyin ve omurilik 8,9 yalıtmak ve yükleme süreci boyunca soğutulmuş aCSF (~ 16 ° C) ile superfused bir banyo, içine koyun. Tip-I sırtını açılış kolay, esnek bir tüp aracılığıyla bir şırınga (1ml U-100 insülin şırınga, Becton Dickenson veya eşdeğeri) bağlanabilir böylece bir elektrot tutucu (H1/12 elektrot tutucu, Narishige) üzerine Pipeti (PharMed yerleştirin BPT, Cole-Parmer, # AY242002; 10 cm) (Fig.1A-B).
3. Boya Uygulama
- Şırınga kullanarak, ilk çizmekTip I-pipetle sınırlandırılır (Şekil 1b; 2A) içine aCSF akson yolu veya (Şek. 2B) doldurulması için kök izledi. Esnek tüp daha sonra geri açılması çıkarılmalıdır. Tip-II pipet başka bir enjektöre bağlanmış ve Tip-I aksonal yolu veya kök tutarak Pipeti eklenir. Bu yüzden artık aCSF sadece aksonal yolu (; 2C-D Fig.1C) kapsar tip-II pipet, aspirat aCSF bağlı şırınga kullanma. Sonra tip-I pipetle tip-II pipet çekebilirsiniz. Aksonal yolu ya da sinirler üzerinde iyi bir sızdırmazlık doğrulamak için birkaç dakika aCSF seviyesi ("iyi bir sızdırmazlık" için Sorun Giderme bölümünde bakınız Bölüm 3) izleyin.
- ACSF içinde boya veya çift distile su içinde% 0.2 Triton X-100 eritin ve hava kabarcıkları dahil etmemeye dikkat ederken Type-II pipet içine çekmek. Tip-I pipet içine ve artık aCSF çözüm (Şekil 2E) içine boya içeren Tip-II pipet yerleştirin. Yavaş yavaş serbest bırakınhafif pozitif basınçlı (Şekil 2F) kullanılarak aCSF içine boya. Herhangi bir hava kabarcığı tanıtmak veya ucun içinden hedef dokuda ötelemeye neden için dikkatli olun. Boya yeterli miktarda (boya çözeltisi 3-5 uL) yayımlanmıştır sonra tip-II pipet çekin.
4. Kuluçka
Deney tipine bağlı olarak 6-20 saat arasında karanlıkta doku inkübe. Bir kez yeterli zaman doldurmak için izin verildi, hafifçe görüntüleme veya histoloji için doku hazır bırakarak doku elektrot acılır.
Sorun Giderme
- Hedef dokuda Tip-I pipet ucu kolayca girmek veya bir zamanlar içinde gevşek değilse, o zaman uç çapı yanlıştır. Bu durumda, çekin ve farklı bir pipet kullanın.
- Tip-I pipet içinde aCSF için boya eklemeden önce, yeterince aCSF bu ulaşılabileceği böylece kalır emin olunTip-II pipet ucu (Şekil 2B). Boya eklenir kez Aksi takdirde, bir hava boşluğu var olacaktır. Bu durumda, boya ekleyin ve pipetle aksonal yolu kaldırın ve Type-II pipet ile ulaşılabilir yeterli aCSF ile geri çekmek değildir.
- Tip I-pipetle artar aCSF seviyesi, Tip II-pipetle aspire edildi sonra, bu doku ile conta iyi olmadığı anlamına gelir. Farklı bir elektrot kullanmak, aksi boya etiketleme prosedürü sırasında seyreltilmiş edilecektir.
- Boya enjekte ederken bir hava kabarcığı Tip-I pipet girmiş ise, kabarcık Type-II pipet yakın ilerleyen ve yavaşça ekli şırınga kullanarak zayıf bir negatif basınç uygulayarak balonu boşaltın.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Yöntemin bir uygulama göstermek için, aynı anda yükleme motonöronlar, duyu afferentleri ve üç farklı Dext ile spinal internöronlardanfloresan boyalar (Şekil 3A)-konjuge koştu. Gibi ölçülmüştür. Nöron 3B, üç sınıf etiketli; duyusal aferentlerde (kırmızı), ventral kordon (yeşil) ve motonöronlar (mavi) içine uzayan internöronlardan.
Şekil 1.. Şematik Pipet gösteren Tip I ve Tip-II montaj. (A) Tip I bu açılma kolayca esnek bir elastomer boru (B) bağlanabilir ve içine bir Tip II pipetle (C) eklenebilir geri var ki pipetle (açık mavi), bir elektrot tutucu üzerine yerleştirilir.
Şekil 2. Şematik floresan boyalarla motonöronlar ve yükleme süreci gösteriyor. (A) Tip-I pipet doldurulacak ventral kök yakın yerleştirilir. (B) Emme kök takiben pipetle içine aCSF çizmek için pipetle uygulanır. (C-D) Tip-I pipet end'deki esnek elastomer tüp ayırın ve Tip-II pipet için emme uygulayarak aCSF miktarını azaltır. (E) Tip I-pipetle içinde kalan aCSF içine eritildi boya içeren Tip II-pipet ucu yerleştirin. (EF) Yavaşça boya ile Tip-I pipet doldurmak ve ardından Tip-II pipet kaldırın.
Şekil 3. İzole fare omuriliğe dolum işlemi uygulanması. (A) şematik gösteren üç Tip-I omurilik farklı nöronal sınıfları doldurmak için kullanılan pipetler. Motonöronlar (mavi; Cascade Mavi dekstran) ve sakral duyusal aferentlerde (kırmızı; Texas-Kırmızı dekstran) sırasıyla, ventral ve dorsal kökleri aracılığıyla backfilled edildi. Floresein dekstran olan aksonlar ventral kordon (VF) aracılığıyla yükselmek spinal internöronlardan (yeşil) yüklemek için kullanılır. Her bir boya dekstran 1 mg (10.000 MW; Molecular Probes)6 uL distile su içeren% 0.2 içinde eritildi Triton X-100 (B). Etiketli duyusal aferentlerde birkaç kontralateral projeksiyonları esas ipsilateral olduğunu A. Not açıklandığı gibi nöronlar arka etiketli olduğu bir omuriliğin sakral kord bir bölümünün Konfokal görüntü. Etiketli internöronlardan dolgu yan (ok başı) kontralateral iken etiketli motonöronlar dolu ventral kök ipsilateral vardır. 200 mikron Kalibrasyon bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
