Summary
وأظهرت استئصال المبيض واستبدال لاحق من استراديول، 17β بواسطة كبسولات silastic ونوتيلا بطريق الفم؛ بالفم في الجرذان والفئران.
Abstract
هرمون الاستروجين هي عائلة من الهرمونات الجنسية الأنثوية مع طيف واسع للغاية من الآثار. عندما تستخدم الجرذان والفئران في البحث هرمون الاستروجين وعادة ما ovariectomized من أجل يجتذ انتاج هرمون ركوب الدراجات بسرعة، لتحل محل خارجيا 17β-استراديول. هناك، مع ذلك، عدم وجود توافق في الآراء بشأن الكيفية التي ينبغي أن تدار هذا الهرمون على الحصول على تركيزات مصل الفسيولوجية. هذا أمر بالغ الأهمية منذ 17β-استراديول مستوى / إدارة طريقة عميقا يؤثر على النتائج التجريبية 1-3. لدينا في سلسلة من الدراسات تتسم أنماط مختلفة من 17β-استراديول الإدارة، وجدت أن كبسولات تحت الجلد silastic ولكل الفم نوتيلا الجوز كريم تعلو على الكريات بطيئة الافراج المتاحة تجاريا (التي تنتجها شركة بحوث مبتكرة من أمريكا) و حقن يومية من حيث تنتج تركيزات مصل الفسيولوجية لل17β-استراديول و 4-6. بين أدفantages طريقة الجوز كريم، الذي سبق واستخدمت لإدارة البوبرينورفين 7، هو أنه عندما تستخدم لإدارة الاستروجين أنها تشبه بطريق الفم؛ بالفم العلاج بالهرمونات البديلة، وهو غير الغازية. وsilastic كبسولات تحت الجلد هي مريحة وتنتج تركيزات مصل الأكثر استقرارا. هذه المادة تحتوي على فيديو خطوة بخطوة المظاهرات من استئصال المبيض و17β-استراديول بالهرمونات البديلة بواسطة كبسولات silastic ونوتيلا بطريق الفم؛ بالفم في الجرذان والفئران، تليها مناقشة جوانب هامة من الإجراءات الإدارية.
Protocol
1. استئصال المبيض عبر الطريق الظهرية
- تخدير الحيوانات، على سبيل المثال باستخدام 1.5٪ isoflurane (4٪ لتحريض) في أكسيد الأوكسجين / النيتروز بنسبة 30٪ / 70٪ خليط. وضع الحيوان في موقف المعرضة على طبق من التدفئة وصله بجهاز مقياس الحرارة المستقيمي. من المهم أن يكون طبقة رقيقة من العزلة بين الحيوان وصحن، وإلى أن مقياس الحرارة التغذية المرتدة نظام يحافظ على درجة حرارة الجسم في غضون 37 ± 0.5 درجة مئوية. تطبيق الهلام لحماية العين وإدارة 5 ملغ Rimadyl / كغ وزن الجسم تضعف في المياه المالحة تحت الجلد على الجانب الوحشي للرقبة الحيوان لتخفيف آلام ما بعد الجراحة.
- حلاقة 4 * 4 سم (3 * 3 سم للفئران) منطقة cephally من عرف الحرقفة. اغسل منطقة حليق مع لJodopax سبيل المثال قبل تغطية الحيوان مع 4 * 4 سم ورقة جراحة فتحة.
- جعل شق 2-3 سم خط الوسط وتشريح بصراحة الجلد من اللفافة الأساسية. واحد سم الجانبي من خط الوسط، وجعل آخر thro شقهتاف اشمئزاز فآسيا. تشريح بصراحة أفقيا تحت هذه اللفافة كما ظاهريا ممكن حتى الوصول الى تجويف البطن.
- باستخدام الملقط، والاستيلاء على الأنسجة الدهنية التي تحيط مبيض في تجويف البطن واسحبه برفق خارج. التعرف على المبيض والرحم ligate قرون والأوعية 0،5-1 سم قريب من هذا الهيكل. قطع المبيض وligated الأنسجة الدهنية، ووضع الظهر الأنسجة المتبقية داخل تجويف البطن. جعل شق آخر في المقابل لفافة وكرر الإجراء.
- إغلاق الجروح، وذلك باستخدام ويفضل أن يكون خياطة حيدة، والسماح للحيوان يستيقظ من التخدير. وضع حيوان في قفص ساخن (25-27 درجة مئوية) خلال ما لا يقل عن 2 ساعة بعد الجراحة. وينبغي أن يكون مقر هذه الحيوانات على حدة في الأيام الأولى بعد العمل الجراحي. فمن المحوري الذي كثيرا ما يتم تنظيف القفص / استبداله خلال مرحلة الانتعاش. أربع وعشرين ساعة بعد الجراحة، وحقن الحيوانات تحت الجلد مع آخر وزن الجسم 5 Rimadyl / كغ ملغ في تخفيفهالمالحة.
2. تحت الجلد الإدارة من استراديول، 17β من خلال كبسولات Silastic
- مزيج دقيق المبلغ المطلوب من استراديول، 17β في زيت السمسم. لتركيزات الفسيولوجية في الجرذان والفئران، ونحن نوصي 180 ميكروغرام / مل و 18-36 ميكروغرام / مل على التوالي. تمتلئ كبسولات الدواء الوهمي مع زيت السمسم النقي.
- قطع 3 سم (2 سم للفئران) أطوال من الأنابيب silastic و 5 مم (3 مم بالنسبة للفئران) أطوال العصي قضيب خشبي ليسد. باستخدام ملقط، ضغط 1 المكونات الخشبية في كبسولة silastic قبل حقن محلول زيت 17β-estradiol/sesame لملء طول. تتويج بلطف الكبسولة silastic في النهاية مفتوحة مع آخر المكونات الخشبية (من المفترض شمعات على البقاء بصورة دائمة في كبسولة). احتضان الكبسولات في حل 17β-استراديول المتبقية بين عشية وضحاها قبل الزرع.
- لا يمكن أن يؤديها زرع كبسولة خلال التخدير المستخدمة في استئصال المبيض في الفئران. عن ميم، ومع ذلك، ينصح بشدة فترة نقاهة لمدة 14 يوما بعد استئصال المبيض لتقليل مخاطر من الكبسولة جاحظ من خلال الجلد هشا.
- بعد استعدادات الجراحية كما هو الحال في 1.1، أو بعد إغلاق شق استئصال المبيض، حلاقة وغسل (أ) 2 * منطقة سم 2 على الجانب الظهري من عنق الحيوان. جعل شق 1 سم وتشريح بصراحة جيب تحت الجلد caudolaterally، مع مساحة وافرة للكبسولة. مسح كبسولة silastic (أن حتى هذه النقطة في الوقت وقد حضنت في حل 17β-استراديول) وتثبيت بلطف من خلال الشق الذي يغلق في وقت لاحق من قبل خياطة. فمن المحوري للتأكد من أن السلالات كبسولة الجلد أقل قدر ممكن، لا سيما في منطقة قريبة من الجرح. من إنتاج كبسولات لزرع، فمن المهم أن يتم تجنب التلوث.
3. بطريق الفم؛ بالفم الإدارة من استراديول، 17β عبر نوتيلا البندق كريم
- حل شامل 17β-استراديول في زيت السمسم، ثم مزج زيت السمسم مع نوتيلا. من المستحسن أن كل جزء يحتوي على 28 ميكروغرام يوميا 17β-استراديول (5)، وزيت السمسم ميكرولتر 1 غرام نوتيلا لكل كيلوغرام من وزن الجسم بالنسبة للفئران و 1.12 ميكروغرام 17β-استراديول، 0،312 زيت السمسم و 60 ميكرولتر نوتيلا ملغ لكل فأر 30-G. يتم إعداد وهمي الجوز كريم مماثل باستثناء دون استراديول-17β.
- تدريب الحيوانات على أكل هرمون خالية من الجوز كريم لمدة خمسة أيام قبل التجربة. الايام الثلاثة الاولى من التدريب ينبغي، على النحو الأمثل الفئران سيتم تدريب في مجموعات (حوالي 0.5 غرام نوتيلا على الحيوانات 2-5)، في أقفاص وطنهم. في اليومين الرابع والخامس من التدريب، ويتم وضع الحيوانات في أقفاص منفصلة قبل ان يحصل على جزء يوميا ليشابه حالة تجريبية.
- أثناء التجربة، يتم وضع الحيوانات في أقفاص منفصلة في كل مناسبة للتغذية، وبعد ذلك يتم تقديم جزء نوتيلا على بلاط السيراميك الصغيرة. إذا كان قد تم تنفيذ التدريب على النحو الوارد أعلاه، ستجربة اور هي أن أكثر من 95٪ من الفئران والجرذان قبول الجوز كريم، ومرة واحدة اعتادوا تماما، معظم هذه الحيوانات أنها تستهلك في غضون ثوان.
4. ممثل النتائج
المصل الفيزيولوجي 17β-استراديول تركيزات، والتي الأساليب الحالية تهدف إلى إعادة إنتاج، ما يقرب من 5-140 جزء من الغرام / مليلتر بالنسبة للفئران و5-35 جزء من الغرام / مليلتر بالنسبة للفئران 4،6. كبسولات تحت الجلد silastic وفقا للتعليمات المذكورة أعلاه، عندما تدار إلى 300 غ من الفئران، سبراغ داولي الإناث، وانخفاض إنتاج ببطء 17β-استراديول تركيزات مصل من حوالي 40 جزء من الغرام / مل اليوم يوم بيكوغرام / مل 2-10 35. ومع ذلك، مباشرة بعد إدارة، يمكن توقع ذروة تركيز مصل الدم حول خريج 1000 / مل، وانخفض إلى مجموعة الفسيولوجية فى غضون 8 ساعات (الشكل 1A) 4،5. الكبسولات silastic عن الفئران الموصوفة أعلاه مع 17β-estradiol/mL ميكروغرام 36، عندما تدار إلى 25 C57BL الإناث ز / الفئران 6، تجعل اضرب المصلentrations أن ينخفض ببطء من ما يقرب من 90 جزء من الغرام / مل يوم 2-25 جزء من الغرام / مل يوم 35. ويسبق هذا على الأرجح من قبل قمة مماثلة كما تم العثور عليه في الفئران، على الرغم من هذا لم يتم التحقيق فيها (الشكل 1B) 6.
ووصف طريقة نوتيلا بطريق الفم؛ بالفم مع جرعات أعلى، عندما تدار إلى 300 الفئران ز سبراغ-داولي الإناث، ويجعل المستويات الفسيولوجية للاستراديول-17β مع التقلبات اليومية بين 10-70 جزء من الغرام / مل (الشكل 2A) 4. بالنسبة للفئران باستخدام جرعة أعلاه، على المستويات اليومية تتراوح ما بين حوالي 20 و 120 جزء من الغرام / مل 6 (الشكل 2B).
iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg "/>
الشكل 2 الرسوم البيانية مجدد تقديم 17β-استراديول التركيزات في الفئران (أ، ن = 15). (4) والفئران (ب، ن = 10) 6 نتيجة للإدارة الهرمون يوميا في نوتيلا. طريقة نوتيلا بطريق الفم؛ بالفم يجعل قمم يوميا، لكن ليس بفارق كبير يصل إلى تنتجها تحت الجلد أو في الوريد طرق. هذا يقلد الدوائية البشرية العلاج بالهرمونات البديلة، والمعاملة بطريق الفم؛ بالفم يمكن المضي قدما لطالما لزم الأمر، حتى لو المثال أعلاه فقط تقديم أولي 96 ساعة. المناطق المظللة تتوافق مع تركيزات 17β-استراديول المصل الفيزيولوجي في إناث الفئران سليمة والفئران على التوالي. حتى ولو لم تظهر بصريا في الرسوم البيانية، وهناك ما بين الفرد التغير في تركيزات 17β-استراديول، مما يجعل معاملات التغير 40-132٪ في الفئران ومن 13 إلى 219٪ في الفئران مع أسلوب نوتيلا (متوسط تركيزات منخفضة للغاية كثيرا ما تولد ارتفاعمعاملات التغير).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ثبت أن وسائل إدارة المعروضة أعلاه لها في الدراسات السابقة متفوقة على الكريات بطء الإفراج التجارية وحقن من حيث تنتج تركيزات مصل الفسيولوجية للاستراديول-17β. في حين الافراج بطيئة الكريات إنتاج عالية جدا وطويلة قمم تركيز مصل الدم، والحقن تسبب المدقع، والتقلبات الهرمونية اليومية وتتطلب معالجة التوتر المتكرر للحيوانات و 4-6. وسلط الضوء على أهمية اختيار وسائل إدارة الكافي من الدراسات التي أجريت مؤخرا تشير إلى أنه في حين أن جرعة منخفضة من نظم إدارة 17β-استراديول (مثل التقنيات المعروضة في المقال الحالي) حماية ضد 8-10 نقص التروية الدماغية، وتركيزات 17β-استراديول التي تنتجها قد التجارية بطيئة الافراج الكريات تزيد في الواقع من ضرر دماغي 1،2،11-14. شرب المياه وإدارة بالتزقيم عن طريق الفم وهما أخرى، أقل تواترا، الطرق التي تم اختبارها. إدارة الهرمون عن طريق مياه الشرب له فوائد عظيمة في كونها غير الغازية للغاية، لأن التعامل مع الحيوانات لا تقريبا في حاجة هو كل شيء. ومع ذلك، 17β-استراديول غير قابل للذوبان في الماء بدون مستحلب، وكمية المياه الفرد هو من الصعب السيطرة عليها، وإذا كان الهدف من ذلك هو أن تعكس استهلاك حبوب منع الحمل، وثمة عيب آخر هو أن الفئران التي تشرب من المياه خلال ال 24 ساعة كاملة . بالتزقيم عن طريق الفم لديه عيب والاكبر في أنه المجهدة للحيوان، وربما تتسبب في إصابة المريء، والتي قد تؤثر على سلوك التغذية.
وصفت وسائل هنا - كبسولات silastic ونوتيلا بطريق الفم؛ بالفم - على حد سواء على المدى القصير مناسبة لإدارة الاستروجين ولفترات أطول تصل إلى 5-6 أسابيع. إذا تم استخدام جرعات أعلى من المذكورة أعلاه، بغض النظر عن نوع من الإدارة المتوسطة، ويمكن على المدى الطويل ادارة هرمون الاستروجين يسبب آثارا جانبية خطيرة مثل انسداد مجرى البول نتيجة لانتشار المخاطية 15.
"لا يمكن بسهولة> الأساليب المقدمة هنا يمكن تعديل الجرعة فيما يتعلق طول كبسولة، وما إلى ذلك وعلى سبيل المثال، قد يكون له ما يبرره ذلك إلى انخفاض كل من جرعات 17β-استراديول في كل من الكبسولات ونوتيلا في نظم الماوس لأكثر ثباتا تحقيق تركيزات المصل الفيزيولوجي 6. ومع ذلك، لا بد إذا تم إجراء أي تعديلات أو في حال استخدام التقنيات في سلالات أخرى من الحيوانات من التحقيق بالفعل، لا بد من التحقق من صحة الأساليب من جديد من خلال قياس 17β-استراديول التركيزات في عينات مصل الدم. يمكن الحصول على هذه العينات المصل في الوقت عدة وقد استخدمت نقاط لتعكس كامل بين الجرعة والاستجابة علاقة / منحنى، وليس مجرد لمحة قصيرة. وزن الرحم من قبل بعض الكتاب بدلا من تركيز 17β-استراديول المصل كمقياس للآثار البيولوجية للاستراديول-17β، ولكن من الواضح وزن الرحم تعكس آثار محددة من هرمون الاستروجين على بطانة الرحم و لا تعبر بالضرورة آثار هرمون الاستروجين على أنظمة أخرى. Furtلها، وضعيف فقط مرتبطة وزن الرحم إلى مستويات هرمون الاستروجين في الدم 4،6.يمكن أن الاستهلاك اليومي من كميات كبيرة من الطاقة الغنية نوتيلا تسبب زيادة الوزن. ومع ذلك، وصفت كميات صغيرة فوق تتوافق فقط إلى أقل من 5٪ من كمية الحيوانات اليومية من الطاقة، والزيادة المفرطة في الوزن وليس لوحظ في دراستنا باستخدام نوتيلا.
الفرق الجوهري في العمل مع الجرذان والفئران تستحق اهتماما خاصا. على الرغم من النظافة التامة محوري بغض النظر عن أنواع الحيوانات والفئران الحساسية للالتهابات تدعو الى التدقيق في مستوى أعلى مما كانت عليه عندما عمل مع الفئران. على سبيل المثال، يجب عدم تطهير دقيق للبشرة قبل التغيير، شق متكررة من القفازات الطبية واستخدام الأدوات الجراحية المعقمة يجوز المساس بها. يزرع دائما ما تكون بؤرا للعدوى. ولذلك يجب أن تفحص الحيوانات بانتظام لعلامات العدوى بعد زرع كبسولة. إذا تم تشكيل لخراج حولعملية الزرع، ونحن نوصي بأن هذا الحيوان هو الموت الرحيم أو أن تتم إزالة الكبسولة، الجرح تنظيفها بدقة، وآخر كبسولة أعاد من خلال شق جديد. مزيد من الجلد على ظهورهم الفئران هي أكثر هشاشة مما كان عليه في الفئران، وقد يستدعي اسبوعين من النقاهة بعد استئصال المبيض قبل إدارة كبسولة.
ويمكن أيضا أن الأساليب المعروضة أعلاه أن تستخدم لمواد أخرى من استراديول، 17β. ومع ذلك، من المهم أن تتميز بدقة الدوائية وجرعات من كل نظام، ويفضل من قبل قياسات المصل على التوالي من المواد الخاضعة للإدارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل جامعة ينكوبينج ومجلس مقاطعة Östergötland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy. |
| Lubrithal eye gel | Leo Laboratories | Eye protection during surgery. | |
| Jodopax vet | Pharmaxim | Surgery disinfection. | |
| Vicryl 4-0 suture | Johnson & Johnson | Wound suture and ovary ligation. | |
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-1G | In sesame oil for silastic capsules and Nutella. |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol. |
| Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm | Dow Corning | 508-008 | Production of silastic capsules. |
| Wooden applicator stick | Selefatrade | 12-0783 | Capping of silastic capsules. |
| Nutella | Ferrero | Medium for peroral 17β-estradiol. |
References
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).
- Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
- Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. , (2011).
- Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
- Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
- Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
- Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
- Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
- Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
- Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
- Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
- Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).
