Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Овариоэктомия и 17β-эстрадиола Замена у крыс и мышей: наглядная демонстрация

Published: June 7, 2012 doi: 10.3791/4013

Summary

Овариоэктомия и последующей заменой 17β-эстрадиола с помощью силиконовой капсулы и пероральный Nutella демонстрируются на крысах и мышах.

Abstract

Эстрогены семьи женских половых гормонов с исключительно широким спектром эффектов. Когда крыс и мышей, которые используются в эстроген исследования они, как правило, яичниками, чтобы удалять быстро велосипеде выработку гормонов, заменив 17β-эстрадиол экзогенно. Существует, однако, отсутствие консенсуса относительно того, как гормон следует применять для получения физиологического раствора концентрации. Это очень важно, так как 17β-эстрадиола уровень / Администрация метод глубоко влияет на результаты эксперимента 1-3. Мы имеем в серии исследований, характеризуется различными видами 17β-эстрадиол администрации, посчитав, что подкожные силиконовые капсулы и за устные орехов крем Nutella превосходит коммерчески доступных медленного высвобождения гранул (производства компании Innovative Research Америки) и ежедневных инъекций по производству физиологических сывороточных концентраций 17β-эстрадиол 4-6. Среди продвинутыхantages ореха мороженого метод, который ранее был использован для бупренорфин администрации 7, в том, что когда он используется для приема эстрогенов она напоминает пероральные заместительной гормональной терапии и является неинвазивным. Подкожный силиконовые капсулы удобны и дают наиболее стабильный сыворотке. Эта статья содержит видео шаг за шагом демонстрации овариэктомии и 17β-эстрадиола гормон замена силиконовые капсулы и пероральный Nutella у крыс и мышей, а затем обсуждение важных аспектов административных процедур.

Protocol

1. Овариоэктомия через спинной маршрута

  1. Анестезию животного, например, с помощью 1,5% ИФ (4% для индукции) в кислород / закись азота 30% / 70% смеси. Поместите животное в положении лежа на нагревательной пластины связаны с ректального термометра. Важно, чтобы тонкий слой изоляции между животным и пластинки, и термометр системы обратной связи поддерживает температуру тела в пределах 37 ± 0,5 ° C. Применение геля для защиты глаз и управлять 5 мг Римадил / кг массы тела растворяется в солевом подкожно на латеральной шеи животного для послеоперационного обезболивания.
  2. Бритье 4 * 4 см (3 * 3 см для мышей) области cephally из гребня подвздошной кости. Тщательно вымойте бритой области, например, с Jodopax до покрытия животное с 4 * 4 см лист хирургия диафрагмы.
  3. Сделайте 2-3 см, срединный разрез и прямо рассекают кожу от основной панели. Один см латеральнее средней линии, сделать еще один разрез беспересадочныйтьфу фасции. Грубо рассекают сбоку под этой фасцией как поверхностно возможно до достижения брюшной полости.
  4. С помощью пинцета возьмите жировой ткани, которая окружает яичника в брюшную полость и осторожно вытащите его. Определить яичников и перевязывать рога матки и сосудов 0,5-1 см проксимальнее этой структуры. Разрежьте яичников и перевязанной жировой ткани и поставьте обратно в тканях брюшной полости. Сделайте еще один разрез в противоположной панели и повторите процедуру.
  5. Закройте раны, предпочтительно с использованием мононити шов, и пусть животное очнуться от наркоза. Поместите животное в клетке с подогревом (25-27 ° С) в течение по крайней мере 2 часа после операции. Животные должны быть размещены отдельно в первые дни после операции. Это имеет решающее значение, что клетки часто очистке / замене на этапе восстановления. Двадцать четыре часа после операции, вводят животным подкожно еще 5 мг Римадил / кг массы тела растворяется вфизиологическим раствором.

2. Подкожного введения 17β-эстрадиола через Silastic капсулы

  1. Тщательно смешать необходимое количество 17β-эстрадиола в кунжутное масло. В физиологических концентрациях у крыс и мышей, мы рекомендуем 180 мкг / мл и 18-36 мкг / мл соответственно. Placebo капсулы наполнены чистым маслом кунжута.
  2. Сокращение 3 см (2 см для мышей) длиной силиконовые трубки, 5 мм (3 мм для мышей) длины деревянные палочки аппликатор для подключения. Используя щипцы, сожмите одну деревянную вилку в силиконовые капсулы перед инъекцией 17β-estradiol/sesame масляного раствора, чтобы заполнить всю длину. Осторожно ограничить силиконовые капсулы в открытый конец с другой деревянные пробки (заглушки должны навсегда остаться в капсуле). Инкубируйте капсулы в остальных 17β-эстрадиол решение ночь перед имплантацией.
  3. Имплантация капсулы могут быть выполнены во время анестезии используется при овариэктомии у крыс. Для мильсе, тем не менее, 14-дневный период восстановления после овариэктомии, настоятельно рекомендуется свести к минимуму риск того, что капсула выступающие через хрупкую кожу.
  4. После хирургической подготовки, как в 1.1, или после закрытия овариэктомии разрез, бриться и мыться 2 * 2 см области на спинной части шеи животного. Сделайте надрез 1 см и резко рассекать подкожный карман caudolaterally, с достаточным пространством для капсулы. Протрите силиконовые капсулы (что до этого времени точка была инкубировали в 17β-эстрадиола раствора) и осторожно установить его через разрез, который впоследствии закрывается швом. Это имеет решающее значение, чтобы убедиться, что капсулы штаммов кожу как можно меньше, особенно в районе, недалеко от ран. В производстве капсул для имплантации, важно, чтобы избежать загрязнения.

3. Перорального введения 17β-эстрадиола через Орех-сливки Nutella

  1. Тщательно растворите 17β-эстрадиола в кунжутное масло, а затем смешать с кунжутным маслом Nutella. Мы рекомендуем, чтобы каждый ежедневно часть содержит 28 мг 17β-эстрадиола, 5 мкл кунжутного масла и 1 г Nutella на килограмм веса тела для крыс и 1,12 мг 17β-эстрадиол, 0,312 мкл кунжутного масла и 60 мг Nutella для каждого 30-г мыши. Placebo орехов крем готовят одинаково, за исключением без 17β-эстрадиол.
  2. Обучение животных есть гормонов орехов крем в течение пяти дней до начала эксперимента. Первые три дня обучения, крысы должны оптимально пройти обучение в группах (около 0,5 г Nutella 2-5 животных), в клетках дома. На четвертый и пятый день обучения, животные помещаются в отдельные клетки до получения ежедневной часть напоминает экспериментальную ситуацию.
  3. В ходе эксперимента животные помещаются в отдельные клетки для каждого кормления раз, после чего часть Nutella подается на небольшие керамические плитки. Если тренировка была выполнена, как указано выше, оур опыт показывает, что более 95% от крыс и мышей принять орех крем, и как только полностью привыкли, большинство животных потреблять его в течение нескольких секунд.

4. Представитель Результаты

Физиологические сыворотки 17β-эстрадиола концентрации, которые современные методы направлены на воспроизведение, около 5-140 пг / мл для крыс и 5-35 пг / мл для мышей 4,6. Подкожный силиконовые капсулы в соответствии с инструкциями выше, при приеме внутрь до 300 г женского Sprague-Dawley крыс, производить медленно убывающих 17β-эстрадиола сыворотке от 40 пг / мл 2-й день до 10 пг / мл 35-й день. Однако сразу же после введения сыворотки максимальной концентрации около 1000 пг / мл можно ожидать, упав на физиологическом диапазоне в течение 8 часов (рис. 1а) 4,5. Силиконовые капсулы для мышей, описанные выше 36 мкг 17β-estradiol/mL, при введении 25 г женщина C57BL / 6 мышей, оказывают сыворотки концентрированнойentrations, которые медленно снижаться с примерно 90 пг / мл 2-й день до 25 пг / мл 35-й день. Это, вероятно, предшествовал аналогичный пик, как было обнаружено у крыс, хотя это не исследовано (рис. 1б) 6.

Пероральный метод Nutella с дозы, описанной выше, при приеме внутрь до 300 г женского Sprague-Dawley крыс, оказывает физиологическое уровней 17β-эстрадиола с суточными колебаниями между 10-70 пг / мл (рис. 2A) 4. Для мышей с использованием выше доза, ежедневные уровни колеблются примерно от 20 до 120 пг / мл (рис. 2В) 6.

Рисунок 1
. Ронг> Рисунок 1 стилизованные представления графов 17β-эстрадиола концентрации у крыс (А, п = 10 временных точек до 24 ч, п = 15 в более поздние времена точек) 4,5 и мышей (B, N = 10) 6 после имплантации капсул. Силиконовые капсулы в течение непродолжительного начального пика концентрации в сыворотке крови до 1000 пг / мл, но снижение в течение нескольких часов до уровней ниже 100 пг / мл. В ближайшие 4-5 недели, капсулы дают стабильный, хотя и неуклонно снижается, сывороточных концентраций. Затененные области соответствуют физиологическим 17β-эстрадиола сыворотке интактных самок крыс и мышей соответственно. Хотя визуально не показал на графиках, то между индивидуальной изменчивости в 17β-эстрадиола концентрации, что делает коэффициенты вариации от 27 до 183% у крыс и от 28 до 115% у мышей с силиконовой метод капсулы (очень низкая средняя Концентрации часто порождают высокие коэффициенты вариации).

iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg "/>
Рисунок 2 стилизованные представления графов 17β-эстрадиола концентрации у крыс (А, п = 15). 4 и мышей (B, N = 10) 6, как следствие ежедневного приема гормонов в Nutella. Пероральный метод Nutella оказывает ежедневное пиков, но не намного выше, чем производства подкожно или внутривенно методами. Это имитирует фармакокинетику человека заместительной гормональной терапии, и питьевого лечения может продолжаться сколь угодно долго, даже если приведенный выше пример только представить первоначальный 96 часов. Затененные области соответствуют физиологическим 17β-эстрадиола сыворотке интактных самок крыс и мышей соответственно. Хотя визуально не показал на графиках, то между индивидуальной изменчивости в 17β-эстрадиола концентрации, что делает коэффициенты вариации от 40 до 132% у крыс и от 13 до 219% у мышей с методом Nutella (очень низкая средняя концентрация зачастую приводит к высокойКоэффициенты вариации).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Администрация режимах приведенные выше есть в более ранних исследованиях доказал свое превосходство в коммерческих медленного высвобождения гранул и инъекций по производству физиологических сывороточных концентраций 17β-эстрадиол. Хотя медленным высвобождением гранулы производят очень высокой и длительной концентрации сывороточного пика, инъекции приводят к крайности, суточные колебания гормонов и требуют повторяющихся стрессовых обработка животных 4-6. Важность выбора адекватного режима администрации подчеркнули последние исследования показывают, что в то время как низкие дозы 17β-эстрадиол администрации схем (например, методы, представленные в данной статье), защиты от церебральной ишемии 8-10, 17β-эстрадиола концентрации производства коммерческие медленного высвобождения гранул может фактически увеличить повреждения головного мозга 1,2,11-14. Питьевая вода администрации и устные зонд два других, менее часто, методы, которые были протестированы. Администрирование гормоны через питьевую воду имеет наибольшую выгоду в том, крайне неинвазивным, так как почти ни одно животное обработки вообще не требуется. Тем не менее, 17β-эстрадиол не растворяется в воде без эмульгатора, отдельных водозаборов трудно контролировать, и если цель состоит в том, чтобы отразить потребления таблетки, еще один недостаток в том, что мышей пить воду в течение всего 24 часов . Устные зонд имеет наибольший недостаток в том, что это стресс для животного, и может вызвать повреждение пищевода, которые могут влиять на пищевое поведение.

Методы, описанные здесь - силиконовые капсулы и пероральный Nutella - оба подходят для коротких администрация эстрогена срок и на более длительные сроки до 5-6 недель. Если высокие дозы используются, чем описанные выше, независимо от типа управления среды, долгосрочного эстрогенов может вызвать серьезные побочные эффекты, такие как закупорка уретры из-за слизистой пролиферацию 15.

"> Методы, представленные здесь, могут быть легко изменены в отношении дозировки, длина капсулы и т.д. Например, это может быть оправдано, чтобы снизить и 17β-эстрадиола дозах и в капсулах и Nutella у мышей схемы более стабильно достижения физиологической сыворотке 6. Однако, если вносятся изменения, или если методы, используемые в других штаммов животных, чем уже исследованы, крайне важно, чтобы проверить методы измерения заново 17β-эстрадиола концентрации в сыворотке крови. Эти образцы сыворотки должен быть получен в несколько раз точки, чтобы отразить весь доза-ответ / кривой, а не просто короткий проблеск. матки весов были использованы некоторые авторы вместо сыворотки 17β-эстрадиола концентрации как мера биологические эффекты 17β-эстрадиол. Тем не менее, очевидно, веса матки отражает специфическое воздействие эстрогенов на эндометрий и не обязательно отражают влияние эстрогенов на других системах. Furtее вес матки слабо коррелирует с уровнем эстрогена сыворотки 4,6.

Ежедневное употребление больших количеств богатых энергией Nutella может привести к увеличению веса. Тем не менее, небольшое количество описанных выше только соответствует менее чем 5% животных, ежедневное потребление энергии и чрезмерное увеличение веса не наблюдается в наших исследованиях с использованием Nutella.

Принципиальная разница в работе с крысами и мышами заслуживает особого внимания. Несмотря на строгие гигиенические имеет решающее значение, независимо от вида животных, мышей чувствительность к инфекции, требует проверки на более высокий уровень, чем при работе с крысами. Например, осторожно дезинфекции кожи перед разрезом, частая смена медицинских перчаток и использования стерильных хирургических инструментов не должна быть нарушена. Имплантаты всегда очагов инфекций. Животные Поэтому необходимо регулярно проверяется на наличие признаков инфекции после имплантации капсул. Если абсцесс формируется вокругимплантата, мы рекомендуем, чтобы животное усыпляют или что капсула удаляется, рана тщательно очищены, а другая капсула восстановлена ​​через новый разрез. Кроме того, кожа на спине мышей гораздо более хрупкие, чем у крыс, требующих двух недель выздоровления после овариэктомии до капсулы администрации.

Методы, представленные выше, могут также быть использованы для других веществ, чем 17β-эстрадиол. Тем не менее, важно, что фармакокинетика и дозы каждый режим тщательно характеризуется, предпочтительно последовательно сыворотки измерения вводят вещества.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Исследование финансировалось Линчепинг университета и совета графства от Östergötland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy.
Lubrithal eye gel Leo Laboratories Eye protection during surgery.
Jodopax vet Pharmaxim Surgery disinfection.
Vicryl 4-0 suture Johnson & Johnson Wound suture and ovary ligation.
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-1G In sesame oil for silastic capsules and Nutella.
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol.
Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm Dow Corning 508-008 Production of silastic capsules.
Wooden applicator stick Selefatrade 12-0783 Capping of silastic capsules.
Nutella Ferrero Medium for peroral 17β-estradiol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
  2. Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).
  4. Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).
  5. Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
  6. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. , (2011).
  7. Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
  8. Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
  9. Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
  10. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
  11. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
  12. Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
  13. Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
  14. Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
  15. Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).

Tags

Медицина выпуск 64 физиологии Овариэктомия крысы мыши 17β-эстрадиол администрация Silastic капсулы Nutella
Овариоэктомия и 17β-эстрадиола Замена у крыс и мышей: наглядная демонстрация
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ström, J. O., Theodorsson, A.,More

Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013, doi:10.3791/4013 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter