Summary
Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.
Abstract
La planaria, un gusano plano de agua dulce, ha demostrado ser un potente sistema para la disección de la regeneración de los metazoos y 1,2 de células madre biología. La regeneración de las planarias de todos los tejidos perdidos o dañados es posible gracias a las células madre adultas denominado neoblastos 3. A pesar de estas células madre han sido definitivamente demostrado ser pluripotentes y singularmente capaz de reconstituir un animal entero 4, la heterogeneidad en la población de células madre y la dinámica de sus comportamientos celulares siguen siendo en gran medida sin resolverse. Debido al gran número y amplia distribución de las células madre a través del plan corporal planaria, métodos avanzados para la manipulación de las subpoblaciones de células madre para el estudio molecular y funcional in vivo son necesarios.
El trasplante de tejidos y la irradiación parcial de dos métodos por los que se puede una subpoblación de células madre de las planarias aislados para estudios posteriores. Cada técnica tiene sus propias ventajas. Tel trasplante de tema permite la introducción de células madre, en un huésped ingenuo, que son intrínsecamente genéticamente distinta o han sido previamente tratados farmacológicamente. Alternativamente, la irradiación parcial permite el aislamiento de células madre dentro de un huésped, yuxtapuesto al tejido desprovisto de células madre, sin la introducción de una herida o cualquier violación de la integridad del tejido. El uso de estos dos métodos, uno puede investigar los factores celulares autónomos y no autónomos-que controlan las funciones de células madre, como la proliferación, diferenciación y migración.
Tanto el trasplante de tejido de 5,6 y la irradiación parcial de 7 se han utilizado históricamente en la definición de muchas de las preguntas acerca de la regeneración de las planarias que permanecen en estudio en la actualidad. Sin embargo, estas técnicas han permanecido infrautilizada debido a la naturaleza laboriosa e inconsistente de los métodos anteriores. Los protocolos que se presentan aquí representan un gran paso adelante en la reducción del tiempo de unaND esfuerzo necesario para generar de forma reproducible un gran número de animales injertados o parcialmente irradiado con eficacias se aproximan al 100 por ciento. Cubrimos la cultura de los animales grandes, la inmovilización, la preparación para la irradiación parcial, el trasplante de tejido, y la optimización de la recuperación de los animales. Además, el trabajo descrito aquí se muestra la primera aplicación del método de irradiación parcial para su uso con la planaria más ampliamente estudiado, Schmidtea mediterranea. Además, el tejido eficiente de injerto en los gusanos abre la puerta a las pruebas funcionales de las subpoblaciones de células madre no tratados previamente o tratados en los ensayos de repoblación, lo que ha sido durante mucho tiempo el método estándar de oro para ensayar el potencial de células madre adultas en los mamíferos 8. La amplia adopción de estas técnicas, sin duda, conducen a una mejor comprensión de los comportamientos celulares de células madre adultas durante la homeostasis del tejido y la regeneración.
Protocol
Nota: este protocolo sugiere el uso de materiales potencialmente peligrosos (plomo y cloretona). Adquirir, lea y siga las MSDS para todos los materiales potencialmente peligrosos.
1. Cultura Animal, selección y preparación
- Para el cultivo y uso de animales manejo del agua planaria (1X sales de Montjuïc 9) y pipetas de plástico de transferencia.
- Sexual biotipo Schmidtea mediterranea se puede utilizar cuando se crían en el laboratorio bajo condiciones de cultivo normales 10. Para producir muestras asexuales de tamaño requerido, S. mediterranea elevado a temperatura ambiente bajo condiciones normales 9 debe ser alimentado al doble de la frecuencia normal de triples (2-3 veces por semana) durante uno o dos meses antes de usar. Alternativamente, los animales asexuales alimentados a la frecuencia normal puede ser mantenida a 10 grados Celsius indefinidamente a fin de aumentar su tamaño medio.
- Seleccione los animales que se encuentran entre 1 a 2 cm delargo y ancho de 2 mm, se mueren de hambre los animales de 3-7 días antes de su uso.
- Si se realiza algún tratamiento farmacológico o radiológicas en los ejércitos destinados, los donantes, o los animales irradiados parte, realizar el tratamiento (s) en este punto.
- Si los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo la necesaria alimentación de los animales, los animales mueren de hambre otros 3 a 7 días antes de su uso.
2. Preparación de Soluciones y Materiales
- Preparar una solución cloretona, un leve anestésico local, mediante la disolución de 0.1-0.2% w / v en agua cloretona planaria y enfriando la solución en hielo.
- Si se realiza la irradiación parcial sólo, vaya al paso 2.7. Para el trasplante de tejido continúe con el paso 2.3.
- El uso de un mechero Bunsen, doblar 0,75 mm de diámetro interior, que se utiliza para cortar el tejido del injerto, y 0,7 mm de diámetro exterior, que se utiliza para crear un agujero en el huésped que recibirá el injerto, tubos capilares a un ángulo de 90 ° a 1-2 cm desde el extremo de EAch tubo. Para guardar los materiales, doble ambos extremos de cada tubo capilar y romper por la mitad para producir dos herramientas. Tenga cuidado de no a las llamas de los confines de los tubos.
- Corte los siguientes documentos a los tamaños indicados:
- Negro filtro de papel (cortado en rectángulos de aprox. 2,5 cm x 1,5 cm)
- Whatman # 3 filtro de papel (cortado en rectángulos de aprox. 2 cm x 0,5 cm)
- Kimwipe (doblada y cortada en tacos aprox. 3 cm x 0,5 cm x 4 capas)
- Rollos de papel de cigarrillos (retire la tira de goma de mascar y cortar en rectángulos de aproximadamente 3 cm x 2 cm)
- Preparar modificada Holtfreter la solución (3,5 g / L de NaCl, 0,2 g / L de NaHCO 3, 0,05 g / l de KCl, 0,2 g / l MgSO 4, 0,1 g / l de CaCl 2, pH 7,0-7,5) y solución saturada de caseína Holtfreter y frío tanto a 4 ° C.
- Adjunte una Kimwipe doblada a un cuadrado de Parafilm y colóquelo en un plato refrigerador Peltier o un dispositivo de refrigeración otra situada bajo un microscopio de disección. Saturar la Kimwipe con Holtf refrigeradasolución de reter y el lugar de dos rectángulos negros de papel de filtro en la Kimwipe.
- Línea de cajas de Petri con papel Whatman n º 2 de papel de filtro. Humedezca el papel de filtro con una solución de Holtfreter y enfriar los platos de hielo. Para la irradiación parcial un plato más grande y el forro de papel de filtro puede ser utilizado.
3. Anestesia y Inmovilización
- Llene una caja de Petri con una solución de cloretona refrigerados y los gusanos de pipeta en el plato. Para el transplante sólo anestesiar un anfitrión y un donante a la vez. Para la irradiación parcial de muchos (n> 10) los animales pueden ser anestesiados a la vez.
- Deje que los gusanos en remojo en la solución cloretona hasta que se convierten inmóvil (5-10 min).
- Enjuague los gusanos con la pipeta en un plato lleno de solución fría de Holtfreter.
- Inmovilizar a los animales con la pipeta que sobre el papel negro de filtro saturado con la solución Holtfreter refrigerada y orientarlos parte ventral hacia abajo con unas pinzas. Si los animales son capaces de locOmote, tomar una solución Holtfreter exceso, ligeramente disminuir la temperatura de la placa Peltier o frío, o aumentar la duración del tratamiento cloretona.
4. La irradiación parcial
Nota: Siga estos pasos para preparar los animales para la irradiación parcial. Si se realiza el trasplante en su lugar, vaya a la sección 5.
- Coloque una fría placa de Petri de la etapa 2.7 en el hielo en un cubo de hielo que se ajuste dentro de una principal fuente de irradiación de rayos-X.
- Organizar animales anestesiados en una placa de Petri moviendo el papel negro filtro en el que están inmovilizados. El uso de pinzas para mover los gusanos anestesiados directamente los puede dañar.
- Transporte dispuestos los animales a una parte superior-fuente de rayos X irradiador y situar el cubo de hielo de tal manera que la distancia desde el tubo de cátodo a los animales se reduce al mínimo, maximizando así la tasa de dosis efectiva.
- Posición de liderazgo escudo (s) (Figura 1) entre los animales y el cátodo de TUbe como se desee. Los blindajes deben ser de 4,5 a 6 mm de espesor para permitir la atenuación del 97% a 99 de un 325kV haz de rayos X 11.
- Entregar dosis de rayos X. Si la ablación completa de células madre de la no-blindados regiones se desea, entregar 30 Gy o más con un irradiador de rayos-X. Para referencia, 30 Gy es equivalente a 3,6 minutos a 320 kilovoltios y 10 miliamperios en una precisión de Rayos-X Inc. XRAD320 con una distancia campo-fuente de 30 centímetros.
- Inmediatamente después de la dosis se ha completado, el manejo de los gusanos por el filtro de papel negro, de transferencia de los animales en el agua fría planaria. Permitir que el agua planaria calentar a temperatura ambiente y los animales a sí mismos desalojar del papel de filtro negro. El procedimiento de irradiación parcial se ha completado.
5. Trasplante de tejido
- Utilizando una pipeta de transferencia y fórceps, organizar anfitrión anestesiados y gusanos donantes en rectángulos separadas de papel de filtro negro en la Kimwipe que ha sido enfriado en el Peltier o enfriador de placas bajo el microscopio de disección.
- El uso de un tubo de 0,75 mm de diámetro capilar interno cortar el enchufe del injerto del donante, y el uso de fórceps, colóquelo en un cabo de la forma en la parte del host. Si el material de injerto se queda atascado en el tubo capilar, desprender con una pinza.
- El uso de un tubo de 0,7 mm de diámetro del capilar externa desconectar un enchufe de la máquina y el uso de pinzas de la posición del injerto en el agujero que se deja atrás.
- Transferir el anfitrión trasplantado en su rectángulo negro papel de filtro en la placa de Petri preparada en la etapa 2.7.
- Moje un pedazo de papel laminado con una solución saturada de caseína Holtfreter y colóquelo en la parte superior de la máquina trasplantado como diagramado en la Figura 2A.
- Remoje cuatro trozos de papel de filtro en la caseína Holtfreter saturada de solución y se encajona en el de acogida trasplantado como diagramado en la Figura 2B.
- Remoje cuatro fajos de Kimwipe corte en la caseína saturada Holtfreter la solución y las ponen sobreel papel de filtro de paso 5,6 (Figura 2B). Vuelva a colocar la tapa y coloque la placa de Petri en el hielo.
- Transferir el gusano planaria de los donantes en el agua para recuperar, reparar y regenerar.
- Cuando todos los trasplantes se han completado, coloque los gusanos trasplantados en un incubador de 10 ° C durante la noche.
- A la mañana siguiente, teniendo cuidado de no perturbar el injerto, descubrir el gusano y la transferencia (en su papel de filtro negro) a una placa de Petri con agua planaria.
- O permiten que el gusano se desplazan desde el papel de filtro o retírela con unas pinzas.
- Cambie el agua planaria una vez cada 2-3 días.
6. Los resultados representativos
Inmediatamente después de la irradiación parcial de la planaria se parecen normales y no afectados. Dependiendo de la dosis suministrada y la geometría del escudo utilizado, el tejido irradiado puede retroceder e incluso desintegrarse 7. Tejido blindado debe permanecer intacto. Follregresión del tejido debido y una pérdida de la integridad del tejido, un blastema se forman estructuras que faltan y se regeneran (Figura 3A). Si una amputación se realiza en la región parcialmente irradiado, el tejido irradiado serán rescatados (es decir, impide la regresión o de desintegración) (Figura 3B). En tanto la lesionada y la regeneración caso amputado se retrasará en comparación con un amputado no irradiado planaria (Figura 3C). Si una dosis de rayos-X de 30 Gy fue entregado y el animal parcialmente irradiado fue la ablación no lesionado, el éxito de células madre en un patrón que corresponde con el escudo de plomo que se utiliza puede ser confirmado 2 a 3 días después de la irradiación parcial de la hibridación in situ de las células madre marcador de Smed-piwi-1 12 (también conocido como smedwi-1) (Figura 4).
A la mañana después de un trasplante, un injerto con éxito del tejido trasplantado debe ser evidentes wn el tejido del huésped, que se han adherido tanto a las superficies dorsal y ventral de la máquina (Figura 5). Ocasionalmente, el injerto se adhiere sólo a la superficie ventral o dorsal. Si el trasplante fue completamente satisfactoria, ninguna señal de que el injerto será visible desde cualquiera de la superficie dorsal o ventral del huésped (Figura 5B). Poco después de un injerto exitoso de tejido no irradiado en un huésped que había sido extirpada de las células madre por la irradiación letal 13,14, hibridación in situ para Smed-piwi-1 se ponen de manifiesto que las células madre están presentes principalmente en el injerto (Figura 5C ). Además, los injertos exitosos de los tejidos no irradiados letalmente irradiados en los ejércitos se traducirá en el rescate de los tejidos del huésped y la supervivencia a largo plazo de la serie 15.
Figura 1. Disposición general de los componentes básicoss para la irradiación parcial. En un irradiador de rayos X con una parte superior posicionado fuente de rayos X (tubo catódico) la planaria anestesiados se coloca directamente debajo de la fuente de rayos X dentro del campo de irradiación. Con el fin de maximizar la tasa de dosis de rayos X, la distancia entre la planaria y la fuente de rayos X debe ser minimizado. Un protector de plomo debe colocarse entre el tubo de cátodo y el gusano anestesiado, lo más cerca posible del gusano como sea posible. El blindaje del cable debe ser diseñado, fabricado y colocado de modo que protege el tejido deseado, pero expone completamente el resto del gusano. Muchos fabricantes comerciales va a producir escudos personalizados de plomo de su diagrama de diseño simple, hemos utilizado con éxito Alpha Systems Corp. (Bluffdale, UT). El plomo debe ser suficientemente gruesa para permitir la cantidad deseada de blindaje. Por ejemplo, si casi completa de un blindaje 320 kV haz de rayos X se desea, el plomo debe ser de 4,5 a 6 mm de espesor. La planaria y el escudo se colocan enun Holtfreter de papel de filtro empapado en fila placa de Petri que descansa en un cubo de hielo. Dado un número suficientemente amplio campo de rayos X de radiación y una serie de protectores de plomo idénticas, muchos ejemplares pueden ser parcialmente irradiado a la vez (no se muestra).
Figura 2. La construcción de la cámara de recuperación. (A) una vista en despiece de la cámara de tejido recuperación del trasplante, mostrando todos los componentes que están en capas sobre una encima de otra después de ser empapado en caseína saturado Holtfreter de solución. (B) Una cámara de recuperación casi terminado, que ilustra la colocación de enclavamiento de la Whatman # 3 rectángulos de papel de filtro que encierra el ajustadamente planaria anestesiados, impidiendo el movimiento durante la curación. La construcción cuidadosa de la cámara de recuperación evita el movimiento de los animales y la desecación, la promoción de una curación rápida y una mayor eficacia del trasplante de tejido.
Figura 3. Resultados representativos de sencilla irradiación parcial posterior. Como Dubois descritas 7, (A) cuando la mitad posterior de las planarias estaban protegidos con plomo y luego expuestos a irradiación con rayos X del tejido anterior se observó que regresar de nuevo a la frontera entre los irradiados y blindado tejido de punto en el que blastemas no pigmentadas formado y los animales comenzaron a regenerar. (B) Por otro lado, cuando los animales fueron decapitados después de la irradiación mismo parcial realizada en (A), la regresión del tejido no se observó y el restante tejido anterior irradiado fue rescatado. El decapitado animales parcialmente irradiadas cabezas regenerada (B), sin embargo, la regeneración se retrasó considerablemente en comparación con los no irradiados controles decapitados (C).
Figura 4. Representante outcome de la ablación parcial de células madre después de la irradiación parcial. todo el montaje hibridación in situ (WISH) para el marcador de células madre Smed-piwi-1 revela que planaria tipo salvaje células madre han distribuido a lo largo de sus cuerpos, con la excepción de que el tejido anterior al fotorreceptores (punta de flecha) y la faringe adecuada 14 (asterisco). (A) Deseo de Smed-piwi-1 en el control irradiado, pero totalmente protegidos planaria fijado tres días después de la irradiación muestra una distribución de células madre que es indistinguible de la de la planaria de tipo salvaje. (B) Por otro lado, deseo de Smed-piwi-1 en los animales que fueron sólo parcialmente protegidos, dejando a la exposición anterior y posterior, pero también se han fijado tres días después de la irradiación muestra que las células madre se realiza la ablación de las regiones no blindados . Las barras de escala son 500 micras.
Figura 5. Examples de trasplante de tejidos con y sin éxito. (A) Imágenes en directo de puntos de vista dorsal y ventral de una planaria trasplantado con éxito tres días después del trasplante. El injerto (indicado) es claramente visible en ambas caras dorsal y ventral, y está rodeada por tejido sin pigmentación característica en la interfaz de injerto-huésped. (B) En consecuencia, los trasplantes fallidos de no mostrar ningún injerto de tejido visible en el sitio del trasplante (indicado) y en lugar de mostrar un curado, la herida no pigmentado, lateral desde el trasplante fracasó. Un injerto que se adhiere a sólo el dorsal o la superficie ventral puede parecerse a un trasplante con éxito (A) cuando se ve desde un lado y un trasplante de éxito (B) cuando se ve desde el otro. (C) Cuando el tipo salvaje (wt) el tejido se injerta en un huésped irradiado que ha sido extirpada de las células madre residentes y las células madre trasplantadas se reveló más tarde por el deseo de Smed-piwi-1 dos días después del trasplante,el éxito del trasplante se muestra claramente por la presencia específica de las células madre sólo en o alrededor de la ubicación del injerto (puntas de flecha). Las barras de escala son 500 micras.
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Discussion
Importancia de la inmovilización
La inmovilización es, con mucho, el paso más crítico para la correcta realización de cualquiera de estos procesos. Si planaria no están bien inmovilizados antes de la irradiación parcial, que puede moverse por debajo de la placa de plomo, produciendo resultados inconsistentes y confusión. Además, si los animales no están lo suficientemente inmovilizada después del trasplante, el gusano anfitrión probable se alejará del tejido del injerto, lo que resulta en un fracaso del injerto para curar apropiadamente para el huésped. Inmovilización adecuada se logra mediante el ajuste de la concentración o duración del tratamiento cloretona y la temperatura y la humedad del papel de filtro en el que el resto planaria. Tratamientos cloretona a 0,2 por ciento de media hora hasta un no parecen ser tóxicos, sin embargo, los tratamientos de longitud que puede inducir la eyección de la faringe. Planaria permanecer quieto y dócil a la irradiación parcial durante este período de tiempo. Nuestra experiencia ha demostrado quela humedad, en lugar del tratamiento cloretona, es el factor más importante - muy húmedo y los animales se mueven con facilidad, muy seco y los animales se secan. En todos los casos un papel de filtro debe estar completamente saturado, pero no hasta el punto de crear el agua estancada en el envase o en la superficie. El exceso de líquido puede salirse de la placa de Petri. La cantidad de líquido utilizado para saturar el papel de filtro, sin duda, ser necesario ajustar de acuerdo con la humedad ambiental específico.
Velocidad de trasplante
La velocidad es esencial en el aumento de la eficacia de ambos irradiación parcial y el trasplante. Los animales ya parcialmente irradiadas se inmovilizan mayor será la probabilidad de una lesión o una presentación de nalgas en la integridad de los tejidos que pueden sesgar los resultados de un ensayo determinado. La velocidad a la que los trasplantes están preformados aproximadamente correlaciona con la tasa de éxito del injerto. Si el agujero en el huésped que va a recibir el injerto se deja vacíadurante demasiado tiempo, las superficies ventral y dorsal heridos comenzará a curar el uno al otro en lugar de al tejido del injerto, lo que resulta en un trasplante de éxito. En nuestras manos, el enchufe del injerto sólo ocasionalmente se aloja en el tubo capilar. En aquellas ocasiones, el tapón puede normalmente ser desalojado rápidamente con unas pinzas finas o forzando el aire a través del tubo capilar por vía oral. Una vez que se convierte en una practica con el procedimiento de trasplante, el tiempo necesario para producir muchos animales injertadas se pueden reducir considerablemente anestesiando la siguiente donante-huésped par mientras que el injerto del par anterior. Mediante la realización de anestesia y el trasplante al mismo tiempo, el tiempo real necesario para producir cada animal injertado puede bajar a tan poco como cinco minutos.
La versatilidad de la irradiación y trasplante parcial
Una vez que las condiciones para la anestesia y la irradiación parcial se han optimizado de acuerdo con el med experimental específicant y el irradiador de rayos X disponibles, el número de experimentos diferentes que pueden llevarse a cabo utilizando la técnica de irradiación parcial se hace grande. Las técnicas avanzadas de mecanizado de plomo permiten la producción no sólo de los escudos de irradiación intrincados que puedan dirigirse a los órganos y tejidos específicos, sino también la fabricación de un gran número de escudos idénticos, permitiendo la creación rápida de biológica muchas repeticiones. Las investigaciones futuras, sin duda, tomar ventaja de este método para probar la in vivo de las respuestas celulares a la ablación localizada de células madre y las diferencias funcionales entre las poblaciones de células madre presentes en diferentes partes del cuerpo del gusano. La versatilidad de la irradiación parcial, en lo que respecta a la cuestión científica de interés, está limitado sólo por las técnicas actuales de plomo de mecanizado y la imaginación de uno. Por lo tanto, el verdadero poder de la técnica de irradiación parcial puede estar en la capacidad de proteger a la ablación precisa y casi cualquier otra posiciónsubpoblaciones de células madre.
Considerando que el trasplante también permite el aislamiento de una subpoblación de células madre, la ventaja más importante de esta técnica es la capacidad para tratar diferencialmente el huésped o de un donante antes del trasplante. El tratamiento de huésped o de un donante con un fármaco o ARN de interferencia, permitirá la investigación de cómo no tratados células trasplantadas se comportan en un entorno de tratamiento o cómo se comportan las células tratadas en un medio ambiente sin tratar. Este tipo de experimentos sin duda ayudará a separar las contribuciones moleculares autónomos y no autónomos para poner freno a la función celular.
Además, como clásicos experimentos de injertos de la planaria ya han demostrado 5,6, el trasplante de tejidos es una técnica ideal para explorar el potencial de inducción de diferentes tejidos durante la regeneración. Como la investigación planaria entra en la era molecular, hemos empezado a descubrir expresión localizada muy específica de importante moléculas de señalización que controlan directamente la regeneración 16. El transplante de tejidos que contienen estas moléculas de señalización de sitios ectópicos durante la regeneración nos puede ayudar a comprender mejor su papel en la dirección de la morfogénesis de las estructuras de la regeneración.
Las ventajas de la irradiación parcial y el trasplante de tejido sobre otras técnicas
Además de las ventajas inherentes específicas que la irradiación parcial y el trasplante de tejido tienen cuando se compara con un otro, sino que también proporcionan ventajas particulares sobre otras técnicas utilizadas en el campo de la regeneración planaria. Por ejemplo, la irradiación de dosis bajas se ha utilizado como una forma de aislar un pequeño número de células madre dentro de una célula huésped de otro modo tallo desprovisto 4,17, sin embargo, porque no sé cómo la irradiación subletal afecta a las células madre de las planarias, no podemos estar seguros de que los comportamientos celulares observados en estos experimentos son característicamente normal.Esta advertencia de la irradiación de dosis baja es menos preocupante en la irradiación parcial debido a exposición a la radiación pueden ser fácilmente atenuada más de 99 por ciento de plomo del espesor adecuado. Por otra parte, el trasplante evita completamente esta advertencia debido a una pequeña población de células madre puede ser aislado dentro de una serie de células madre carece sin la exposición de las células trasplantadas a la radiación. Además, la posición exacta de las células madre sanas puede ser conocida y controlada, tanto en la irradiación y trasplante parcial, mientras que las células supervivientes irradiación dosis baja están posicionados aleatoriamente a través del animal. Finalmente, mientras que el trasplante de células solo ha demostrado elegantemente el alto potencial de una célula de planaria solo vástago 4, el trasplante de tejido puede resultar una técnica igualmente poderosa porque es más rápida, menos tedioso, y la función y el comportamiento de un número de células se puede observar simultáneamente en cada host. El análisis de una pequeña población de célulasfrente a una sola célula no sólo permite la recolección más eficiente de los datos, pero también puede revelar interacciones célula-célula que se puede perder en una sola celda de ensayo del trasplante.
Conclusión
La irradiación parcial y el trasplante de tejido, aunque las viejas técnicas, jugará un papel importante en la disección de las funciones de las células madre de las planarias, así como los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración en general. La modernización de las técnicas clásicas ha traído un mayor rendimiento y una mayor coherencia al tiempo que permite la integración de los modernos ensayos funcionales y técnicas moleculares. Estas técnicas clásicas que se han utilizado una vez para esbozar las cuestiones más importantes de la regeneración de las planarias se pueden utilizar ahora para descubrir las respuestas a esas preguntas y por lo tanto aún más nuestra comprensión de la biología de células madre.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Chiyoko Kobayashi y Agata Kiyokazu de consejos útiles sobre el trasplante de planaria, así como los miembros anteriores y actuales del laboratorio de Sánchez de discusión muy valiosa durante el desarrollo de estas técnicas. Este trabajo fue apoyado por el NIH Formación Grant (5T32 HD0791) a la Oficina del Contralor General y los NIH R37GM057260 a ASA. ASA es un Médico Howard Hughes, investigador del Instituto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 | |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 | |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 | |
| Black filter paper | Schleicher Schuell | 10310809 | |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B | |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E | |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA | |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 | |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 | |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 | |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 | |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design | |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
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