Summary
En effektiv metod för ympning av vävnad definierad och enhetlig storlek mellan planaria beskrivs. Dessutom ingår en beskrivning av hur immobilisering som används för transplantation kan anpassas i samband med bly sköldar, för den partiella bestrålning av levande djur.
Abstract
Den planarian, en sötvattens plattmask, har visat sig vara ett kraftfullt system för dissekera flercelliga förnyelse och stamcellsbiologi 1,2. Planarian regenerering av alla saknade eller skadade vävnader görs möjligt genom adulta stamceller kallas neoblasts 3. Även om dessa stamceller har definitivt visat sig vara pluripotenta och i singularis kan rekonstruera en hel djur 4, heterogenitet inom stamceller befolkningen och dynamiken i deras cellulära beteenden i stort sett olösta. Grund av det stora antalet och stor spridning av stamceller i hela kroppen planarian plan är avancerade metoder för att manipulera subpopulationer av stamceller för molekylär och funktionella studier in vivo behövs.
Vävnadstransplantation och partiell bestrålning är två metoder genom vilka en subpopulation av planarian stamceller kan isoleras för ytterligare studium. Varje teknik har olika fördelar. TFrågan transplantation tillåter introduktion av stamceller, in i en naiv värd, som är antingen i sig genetiskt distinkt eller tidigare har behandlats farmakologiskt. Alternativt kan partiell bestrålning för isolering av stamceller i en värd, placerad intill vävnad som saknar stamceller, utan införande av ett sår eller någon bakstyckskammaren i vävnadsintegritet. Med hjälp av dessa två metoder kan man undersöka cell autonoma och icke-självständiga faktorer som styr stamceller funktioner såsom proliferation, differentiering och migration.
Både vävnadstransplantation 5,6 och partiell bestrålning 7 har använts historiskt för att definiera många av de frågor om planarian förnyelse som finns kvar under utredning i dag. Emellertid har dessa tekniker förblivit underanvända på grund av det mödosamma och inkonsekvent typ av tidigare metoder. Protokollen som presenteras här utgör ett stort steg framåt i att minska tiden ennd ansträngning krävs för att reproducerbart generera ett stort antal ympade eller partiellt bestrålade djur med effektiviteter som närmar 100 procent. Vi täcker kulturen av stora djur, immobilisering, förberedelse för partiell bestrålning, vävnad transplantation, och optimering av djur återhämtning. Dessutom visar det arbete som beskrivs här den första tillämpningen av den partiella bestrålning för användning med det mest studerade planarian, Schmidtea Mediterranea. Dessutom öppnar effektiv vävnadstransplantation i planaria dörren för funktionell testning av subpopulationer av naiva eller behandlad stamceller i återinplantering av analyser, som länge har varit guld-standarden metod för att analysera vuxna potential stamceller hos däggdjur 8. Omfattande införande av dessa tekniker kommer utan tvekan att leda till en bättre förståelse av de cellulära beteenden hos vuxna stamceller under vävnadshomeostas och förnyelse.
Protocol
Obs: detta protokoll föreslår användning av potentiellt farliga material (bly och chloretone). Förvärva, läs och följ MSDS för alla potentiellt farliga material.
1. Animal Kultur, urval, och beredning
- För djur kultur och hantering användning planarian vatten (1X Montjuïc salter 9) och plastpipetter överföring.
- Sexuell biotyp Schmidtea Mediterranea kan användas när upp i laboratoriet under normala odlingsbetingelser 10. För att producera asexuella exemplar av erforderlig storlek, S. Mediterranea upp vid rumstemperatur under normala förhållanden 9 bör matas med dubbla eller trippla normal frekvens (2-3 gånger per vecka) under en till två månader före användning. Alternativt kan asexuella djur som utfodrats med normal frekvens hållas på 10 grader Celsius på obestämd tid för att öka deras genomsnittliga storlek.
- Välja djur som är mellan 1 till 2 cm ilängd och bredare än 2 mm svälta då djuren 3-7 dagar före användning.
- Om utföra några farmakologiska eller radiologiska behandlingar avsedda värdar, givare, eller delvis bestrålade djur, utföra behandling (er) på denna punkt.
- Om farmakologisk behandling utfördes som krävs mata djuren, svälter djuren ytterligare 3 till 7 dagar före användning.
2. Framställning av lösningar och material
- Framställ chloretone lösning, en mild lokal anestetisk, genom upplösning 0,1-0,2% vikt / volym chloretone i planarian vatten och kylning av lösningen på is.
- Om utföra partiell bestrålning bara gå vidare till steg 2,7. För vävnadstransplantation fortsätta till steg 2,3.
- Användning av en Bunsen-brännare, böj 0,75 mm inre diameter, som används för att skära transplantatvävnad och 0,7 mm yttre diameter, används för att skapa ett hål i den värd, som skall transplanteras, kapillärrör till en 90 ° vinkel vid 1-2 cm från slutet av eaCH röret. För att spara material, böja båda ändarna av varje kapillärrör och dela upp dem i halv för att producera två verktyg. Var noga med att inte eld själva ändarna av rören.
- Klipp följande papper till de angivna storlekar:
- Svart filterpapper (skuren i rektanglar ca 2,5 cm x 1,5 cm)
- Whatman # 3 filterpapper (skärs i rektanglar ca 2 cm x 0,5 cm)
- Kimwipe (vikas och skäras till propparna ca. 3 cm x 0,5 cm x 4 skikt)
- Cigarettpapper rullande papper (ta bort tuggummi band och skärs i rektanglar ca 3 cm x 2 cm)
- Framställa modifierade Holtfreter lösning (3,5 g / L NaCl, 0,2 g / L NaHCOs 3, 0,05 g / L KCl, 0,2 g / L MgSO 4, 0,1 g / L CaCl2, pH 7,0-7,5) och kasein mättad Holtfreter lösning och kyla både till 4 ° C.
- Fäst en vikt Kimwipe till en kvadrat med Parafilm och lägg på Peltierkylare skylt eller annan kylanordning ligger under ett dissektionsmikroskop. Mätta Kimwipe med kylda Holtfreter lösning och plats två svarta filter papper rektanglar på Kimwipe.
- Linje Petri rätter med Whatman # 2 filterpapper. Fukta filtret papperet med Holtfreter lösning och kyla rätter på is. För partiell bestrålning en större antenn och filterpapper fodret kan användas.
3. Bedövning och Immobilisering
- Fyll en petriskål med kyld chloretone lösning och maskar pipetten i skålen. För transplantation bara bedöva en värd och en donator åt gången. För partiell bestrålning många (n> 10) djur kan bedövas på en gång.
- Låt maskar i blöt i chloretone lösningen tills de blir orörliga (5-10 min).
- Skölj maskar genom att pipettera dem i en skål fylld med kyld Holtfreter lösning.
- Immobilisera djur genom pipettering upp dem på svart filterpapper mättat med kyld Holtfreter lösning och orientera dem ventrala sidan nedåt med pincett. Om djur kan locOmote, suga upp överskottet Holtfreter lösning, något minska temperaturen i Peltier eller kallt plåt eller öka längden på chloretone behandling.
4. Partiell Bestrålning
Obs: Följ dessa steg för att förbereda sig djur för partiell bestrålning. Om utföra transplantation istället gå vidare till avsnitt 5.
- Placera en kyld petriskål från steg 2,7 på is i en ishink som passar i en top källa X-ray bestrålare.
- Ordna sövda djur i en petriskål genom att flytta den svarta filterpapperet på vilka de är immobiliserade. Använd pincett för att flytta sövda maskar direkt kan skada dem.
- Transport ordnas djur till en topp-source X-ray bestrålare och placera isen hinken så att avståndet från katoden röret till djuren minimeras och därmed maximera den effektiva dosen.
- Position blyskärm (s) (Figur 1) mellan djuren och katoden tUbe önskas. Skärmarna skall vara från 4,5 till 6 mm tjockt för att medge för 97 till 99% dämpning av en 325kV röntgenstråle 11.
- Leverera röntgen dos. Om fullständig stamceller ablation från icke-skärmad regioner önskas levererar 30 Gy eller mer med hjälp av en X-ray bestrålare. För referens är 30 Gy motsvarande 3,6 minuter vid 320 kilovolt och 10 milliampere i ett Precision X-Ray Inc. XRAD320 med ett fält till-source avstånd på 30 centimeter.
- Omedelbart efter dosering är klar, hantering maskar av den svarta filterpappret, överföra djur till kylt planarian vatten. Tillåta planarian vatten för att värma upp till rumstemperatur och djuren att lösgöra sig från svart filterpapper. Den partiella bestrålning Förfarandet är nu klar.
5. Vävnadstransplantation
- Med hjälp av en överföringspipett och pincett, ordna sövda värd och maskar givare på separata rektanglar av svart filterpapper på Kimwipe som kylts på PeltiER eller kylare plattan under dissektionsmikroskop.
- Användning av en 0,75 mm innerdiameter kapillärrör utskuren transplantatet pluggen från donatorn, och med användning av pincett och placeras på en ur vägen delen hos värden. Om graftmaterialet fastnar i kapillärröret, få bort med pincett.
- Med en 0,7 mm ytterdiameter kapillärrör bort en plugg från värden och använda pincett läget transplantatet i hålet som är kvar.
- Överföra den transplanterade värd på dess svarta filterpapper rektangel i petriskålen som framställts i steg 2.7.
- Blöt en bit av rullande papper med kasein mättad Holtfreter lösning och placera den på toppen av det transplanterade värden som i diagramform i figur 2A.
- Blötlägg fyra bitar av filterpapper i kasein mättad Holtfreter lösning och innesluter det transplanterade värd som i diagramform i figur 2B.
- Blötlägg fyra buntar med snitt Kimwipe i kasein mättad Holtfreter lösning och lägga dem överfilterpappret från steg 5,6 (Figur 2B). Sätt tillbaka locket och sätta petriskål på is.
- Överför givaren masken i planarian vatten för att återhämta sig, läka, och regenerera.
- När alla transplantationer är klara, placera de transplanterade maskarna i en 10 ° C inkubator över natten.
- Följande morgon, noga med att inte störa transplantatet, avslöja masken och överföra den (på sin svarta filterpapper) till en petriskål fylld med planaria vatten.
- Antingen tillåta masken att rubba sig från filterpapper eller försiktigt bort det med pincett.
- Ändra planarian vatten en gång varje 2-3 dagar.
6. Representativa resultat
Omedelbart efter att delvis ha bestrålning planaria visas normalt och opåverkad. Beroende på tillförd dos och geometrin hos den använda skölden kan bestrålade vävnaden tillbaka och även sönderdelas 7. Skärmad vävnaden bör förbli intakt. Follpå grund av vävnad regression och en förlust av vävnad integritet kommer en blastema bildas och saknade strukturer kommer att regenereras (Figur 3A). Om en amputation görs i den delvis bestrålade området skall det bestrålade vävnaden räddas (dvs förhindras från att gå bakåt eller sönderfallande) (Figur 3B). I både den oskadade och den amputerade fallet regenerering kommer att fördröjas i förhållande till en amputerad icke-bestrålade planaria (figur 3C). Om en X-ray dos av 30 Gy levererades och den delvis bestrålade djuret var oskadd, framgångsrik stamcell ablation i ett mönster som motsvarar den använda blyskärm kan bekräftas 2 till 3 dagar efter att delvis ha bestrålning med in situ hybridisering för stamceller markör Smed-Piwi-1 12 (aka smedwi-1) (Figur 4).
Morgonen efter transplantation, en framgångsrik transplantat av den transplanterade vävnaden borde vara uppenbart wnom värdvävnaden, efter att ha vidhäftat till både dorsala och ventrala ytorna av den mottagande (figur 5A). Ibland kommer transplantatet vidhäfta endast den ventrala eller dorsala ytan. Om transplantation var helt misslyckas, kommer inga tecken på transplantatet vara synlig från antingen den dorsala eller ventrala ytan av den mottagande (figur 5B). Kort efter en framgångsrik ympning av icke-bestrålade vävnaden in i en värd som hade ablateras av stamceller genom letal bestrålning 13,14, in situ hybridisering för Smed-Piwi-1 kommer att avslöja att stamceller är närvarande i första hand inom transplantatet (figur 5C ). Dessutom kommer framgångsrika transplantat av icke-bestrålade vävnaden i dödligt bestrålade värdar resultera i räddningen av värdens vävnad och långsiktig överlevnad av värden 15.
Figur 1. Allmänt arrangemang av grunddelens för partiell bestrålning. I en röntgenbild bestrålare med en placerad överst röntgenkällan (katodrör) är sövd planarian placerad direkt under röntgenkällan inom bestrålning området. För att maximera röntgen dosering, bör avståndet mellan planarian och röntgenkällan minimeras. En blyskärm bör placeras mellan katoden röret och bedövades masken, så nära masken som är praktiskt. Blyet skärm bör vara konstruerade, tillverkade och placerade så att den skyddar den önskade vävnaden men helt exponerar resten av masken. Många kommersiella tillverkar kommer att producera egna bly skyddar från din enkla design diagrammet, vi har med framgång använt Alpha Systems Corp (Bluffdale, UT). Ledningen bör vara tillräckligt tjockt för att medge den önskade mängden av skärmning. Till exempel, om nästan fullständig avskärmning av en 320 kV röntgenstråle önskas bör ledningen vara 4,5 till 6 mm tjock. Den planarian och skölden är placerade påen Holtfreter är indränkt filterpapper fodrade petriskål, som vilar i en ishink. Givet en tillräckligt stor röntgenbestrålning fält och ett antal identiska bly sköldar, kan många prover delvis bestrålas på en gång (ej på bild).
Figur 2. Bygga återvinningskammaren. (A) En sprängskiss av vävnadstransplantation återvinningskammaren, som visar alla de komponenter som är skiktade ovanpå varandra efter att de blötlagts i kasein mättad Holtfreter lösning. (B) En nästan avslutad återvinningskammaren, och illustrerar den sammankopplande placeringen av Whatman # 3 filterpapper rektanglar som tätt omsluter den sövda planarian, vilket förhindrar rörelse under läkning. Den försiktiga byggandet av återhämtningen kammarens förhindrar djurförflyttningar och uttorkning, främja en snabb läkning och större effektivitet av vävnad transplantation.
Figur 3. Representativa resultat av enkla bakre partiell bestrålning. Som Dubois beskrivs 7, (A) vid den bakre halvan av planarier var skyddade med bly-och utsattes sedan för röntgenstrålning den främre vävnaden observerades gå tillbaka tillbaka till gränsen mellan bestrålade och skärmade vävnaden vid vilken punkt opigmenterade blastemas bildas och djuren började återhämta sig. (B) Å andra sidan, när djuren halshöggs efter samma partiella bestrålning utförs i (A), var vävnaden regression observerades inte och resterande bestrålade främre vävnaden räddades. Den halshuggna delvis bestrålade djuren regenererade huvuden (B), var dock förnyelse kraftigt försenad jämfört med obestrålade avhuggna kontroller (C).
Figur 4. Representativ outcomig om partiell stamceller ablation efter att delvis ha bestrålning. Hela-mount i situ hybridisering (WISH) för stamceller markören Smed-Piwi-1 visar att vildtyp planaria har stamceller distribueras i hela kroppen, med undantag av vävnaden främre till fotoreceptorer (pilspets) och svalget korrekt (asterisk) 14. (A) vill för Smed-Piwi-1 i bestrålade men fullt skärmad kontroll planaria fast tre dagar efter bestrålning visar en fördelning stamcell som inte går att skilja från den av vildtyp planaria. (B) Å andra sidan vill för Smed-Piwi-1 i djur som endast delvis skyddade och lämnar den främre och bakre exponerade, men även fast tre dagar efter bestrålning visar att stamceller borttagen från de icke-avskärmade områden . Skala barer är 500 mikrometer.
Figur 5. Examples av lyckade och misslyckade vävnad transplantation. (A) Live bilder av dorsala och ventrala utsikt över ett framgångsrikt transplanterade planarian tre dagar efter transplantation. Transplantatet (indikerade) är klart synliga på båda dorsala och ventrala ytorna och omges med karakteristiska opigmenterad vävnaden vid transplantat-värd-gränsytan. (B) motsvarande misslyckade transplantationer visa några synliga transplantatvävnad vid transplantation platsen (visas) och i stället visar ett läkt, opigmenterad, lateral såret från den misslyckade transplantation. En graft som häftar endast den dorsala eller den ventrala ytan kan likna en lyckad transplantation (A) när den betraktas från en sida och en misslyckad transplantation (B) när det betraktas från den andra. (C) När vildtyp (wt) vävnad ympas in i en bestrålad värd som har borttagen av inhemska stamceller och de transplanterade stamcellerna är senare avslöjas av önskan Smed-Piwi-1 två dagar efter transplantation,framgången för transplantation visas tydligt genom den specifika närvaron av stamceller endast i eller runt implantatet plats (pilspetsar). Skala barer är 500 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelsen av immobilisering
Immobilisering är den i särklass mest kritiska steget för ett framgångsrikt slutförande av någon av dessa processer. Om planaria är felaktigt immobiliseras före partiell bestrålning, kan de röra sig under blyskärm, som producerar inkonsekventa och confounding resultat. Dessutom, om djuren inte är tillräckligt immobiliserade efter transplantation, kommer värden masken rör sig sannolikt från transplantatvävnad, vilket resulterar i ett fel i transplantatet att läka ordentligt värden. Korrekt immobilisering åstadkommes genom justering av koncentrationen eller längden av chloretone behandling och temperaturen och fuktigheten hos filterpapperet på vilken planaria resten. Chloretone behandlingar på 0,2 procent upp till en halvtimme inte verkar vara giftiga, men kan behandlingar av denna längd inducerar utstötning av svalget. Planaria kvar och kan bli föremål för partiell bestrålning under denna tidslängd. Vår erfarenhet har visat attfukt, snarare än chloretone behandling är den mest avgörande faktorn - för våt och djuren rör sig lätt, för torrt och djuren kommer att torka ut. I samtliga fall filterpapper bör vara fullständigt mättade, men inte till den punkt att skapa stående vatten inuti behållaren eller på ytan. Överskottsvätska kan skakas från petriskålen. Mängden vätska som används för att mätta filterpapper kommer utan tvivel att behöva justeras i enlighet med den specifika en fuktig omgivning.
Speed of transplantation
Hastigheten är väsentliga för att öka effektiviteten av både partiell bestrålning och transplantation. Ju längre delvis bestrålade djuren är immobiliserade desto större är chanserna för en skada eller en sätesbjudning i vävnad integritet som kan förvränga resultaten i en viss analys. Den hastighet med vilken transplantationer är förformade korrelerar ungefär med den framgångsrika transplantat takt. Om hålet i värden som skall ta emot transplantatet lämnas tomtalltför länge, kommer de sårade ventrala och dorsala ytorna börja hela till varandra snarare än att transplantatet vävnaden, vilket sålunda resulterar i en misslyckad transplantation. I våra händer, transplantatet kontakten endast ibland fastnar i kapillärröret. Vid dessa tillfällen kan pluggen normalt skulle lossna snabbt med fin pincett eller genom att tvinga luft genom kapillärröret via munnen. När man blir utövas med transplantationen förfarande behövde tid för att producera många ympade djur avsevärt kan minskas genom bedövning nästa donator-värd paret, medan ympning föregående paret. Genom att utföra bedövning och transplantation samtidigt, kan den faktiska tid som krävs för att producera varje ympade djur sjunka till så lite som fem minuter.
Mångsidigheten av partiell bestrålning och transplantation
När villkoren för anestetisering och partiell bestrålning optimeras beroende på den specifika experimentella environmennt och den tillgängliga röntgen bestrålare, blir antalet olika experiment som kan utföras med användning av den partiella bestrålning tekniken stor. Avancerade bly bearbetning tekniker möjliggör produktion av inte bara intrikata bestrålning sköldar som kan rikta specifika organ och vävnader, men även för tillverkning av ett stort antal identiska sköldar, för snabbt skapa många biologiska replikat. Framtida undersökningar kommer utan tvekan dra nytta av denna metod för att testa in vivo cellulära svaren lokal stamceller ablation och funktionella skillnader mellan populationer stamceller som finns i olika delar av planarian. Mångsidigheten för partiell bestrålning, eftersom det avser den vetenskapliga frågan av intresse, begränsas endast av nuvarande teknik bly bearbetning och en fantasi. Därför kan den verkliga kraften i den partiella bestrålning tekniken ligger i förmågan att exakt skydda och avlägsna nästan annorlunda placeradesubpopulationer av stamceller.
Medan transplantation också medger isolering av en subpopulation av stamceller, desto mer betydande fördel med denna teknik möjligheten att differentiellt behandla den värd eller donator före transplantation. Behandling av värd eller givare med ett läkemedel eller RNA-interferens, kommer att möjliggöra undersökning av hur obehandlade transplanterade celler beter sig på en behandlad miljö eller hur behandlade celler beter sig i en obehandlad miljö. Dessa typer av experiment kommer säkert att bidra till att retas isär autonoma och icke-självständiga molekylära bidrag för att hejda cellfunktion.
Dessutom, eftersom klassiska ympning experiment i planaria har redan visat 5,6, är vävnad transplantation en idealisk metod för att utforska induktiva potential olika vävnader under regenerering. Som planarian forskningen kommer in i molekylära ålder har vi börjat att upptäcka mycket specifik lokal uttryck för important signalmolekyler som direkt styr regeneration 16. Transplantera vävnader som innehåller dessa signalmolekyler till ektopiska ställen under regenereringen kan hjälpa oss att bättre förstå sin roll i att styra morfogenes att regenerera strukturer.
Fördelarna med partiell bestrålning och vävnadstransplantation över andra tekniker
Förutom de inneboende specifika styrkor som delvis bestrålning och vävnad för transplantation jämfört med varandra, ger de också särskilda fördelar jämfört med andra tekniker som används i planarian förnyelse fältet. Till exempel har låga doser strålning använts som ett sätt att isolera ett litet antal stamceller i en i övrigt stamcell saknar värd 4,17, men eftersom vi inte vet hur subletal bestrålning påverkar planarian stamceller, kan vi inte vara säkra att de cellulära beteenden observeras i dessa experiment är karakteristiskt normala.Denna nackdel med låg dos strålning är mindre ett problem i partiell bestrålning eftersom exponeringen för strålning kan lätt dämpas mer än 99 procent med ledning av rätt tjocklek. Vidare undviker transplantation helt detta förbehåll eftersom en liten population av stamceller kan isoleras i en stamcell saknar värden utan att någonsin utsätta de transplanterade cellerna för strålning. Vidare kan den exakta positionen för de friska stamceller vara känd och kontrollerad i både partiell bestrålning och transplantation, medan de celler som överlever en låg dos bestrålning är placerade slumpmässigt genom hela djuret. Slutligen, medan en enda cell transplantation har elegant visat stor potential av en enda planarian stamcell 4, kan vävnaden transplantation bli en lika kraftfull teknik eftersom den är snabbare, mindre tråkiga och funktionen och beteende av ett antal celler kan observeras samtidigt i varje värd. Analysen av en liten population av cellerjämfört med en enda cell inte bara möjliggör mer effektiv insamling av data, men det kan också avslöja cell-cell-interaktioner som skulle missas i en enda cell transplantation analys.
Slutsats
Partiell bestrålning och vävnad transplantation, även gamla tekniker, kommer att spela en viktig roll i dissekera funktioner planarian stamceller samt de allmänna molekylära mekanismerna bakom regeneration. Modernisering av dessa klassiska tekniker har fört högre kapacitet och större konsekvens samtidigt för integrering av moderna funktionella analyser och molekylära tekniker. Dessa klassiska tekniker som en gång användes för att beskriva viktiga frågor om planarian förnyelse kan nu användas för att upptäcka svaren på dessa frågor och därmed ytterligare vår förståelse av stamcellsbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Chiyoko Kobayashi och Kiyokazu Agata för goda råd om planarian transplantation samt tidigare och nuvarande medlemmar i Sánchez labb för ovärderliga diskussioner under utvecklingen av dessa tekniker. Detta arbete stöddes av NIH Training Grant (5T32 HD0791) att OCG och NIH R37GM057260 till ASA. ASA är en Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 | |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 | |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 | |
| Black filter paper | Schleicher Schuell | 10310809 | |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B | |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E | |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA | |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 | |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 | |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 | |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 | |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design | |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 Forthcoming.
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l 'ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
