Summary
Эффективный метод для пересадки ткани определенной и последовательной размер между планарии описано. Также имеется описание того, как иммобилизация метод, используемый для трансплантации могут быть адаптированы в сочетании с ведущим щиты, для частичного облучения животных.
Protocol
Примечание: этот протокол предполагает использование потенциально опасных материалов (свинец и chloretone). Приобретать, читать и следовать MSDS для всех потенциально опасных материалов.
1. Животное культуры, селекция и подготовка
- Для культуры животных и обращения с использованием планарий воды (1X Монжуик соли 9) и пластиковые пипетки передачи.
- Сексуальные биотип Schmidtea Mediterranea могут быть использованы при поднятых в лаборатории при нормальных условиях культуры 10. Для получения бесполого образцы необходимого размера, С. Mediterranea подняты при комнатной температуре при нормальных условиях 9 должны быть поданы в двойной утроить нормальной частоты (2-3 раза в неделю) в течение одного-двух месяцев до начала использования. Кроме того, бесполое животных, которых кормили при нормальной частоте может быть в 10 градусов по Цельсию на неопределенное время в целях увеличения их среднего размера.
- Выберите животных, от 1 до 2 смДлина и шире, чем 2 мм, то голодать животных 3-7 дней до начала использования.
- При выполнении любых фармакологических или радиологического лечения от предполагаемого хостов, доноров или частично облученных животных, выполнять лечение (ы) в этой точке.
- Если фармакологическое лечение было проведено, что требуется кормление животных, животные голодают дополнительные 3 до 7 дней до начала использования.
2. Подготовка решений и материалов
- Подготовить chloretone решение, мягкий местной анестезией, при растворении 0,1-0,2% вес / объем chloretone в планарии воды и охлаждения раствора на лед.
- При выполнении частичного облучения только, переходите к шагу 2.7. Для трансплантации тканей продолжают на шаг 2.3.
- С помощью горелки Бунзена, согните 0,75 мм внутреннего диаметра, используемых для резки ткани трансплантата, и 0,7 мм внешний диаметр, используются для создания отверстий в принимающей который получит трансплантата, капиллярных трубок на 90 градусов на 1-2 см С конца еч трубку. Для экономии материалов, согните оба конца каждого капилляра и разорвать их пополам, чтобы производить два разных инструмента. Будьте осторожны, не пламя самого конца трубы.
- Вырезать следующие документы указанного размера:
- Черный фильтровальной бумаги (нарезать прямоугольниками примерно. 2,5 см х 1,5 см)
- Ватман № 3 фильтровальной бумаги (нарезать прямоугольниками примерно. 2 см х 0,5 см)
- Kimwipe (в сложенном и нарезать около пачки. 3 см х 0,5 см х 4-слойные)
- Сигареты прокатки бумаги (убрать резинку полосу и нарезать прямоугольниками примерно. 3 см х 2 см)
- Подготовить изменения в решение Holtfreter (3,5 г / л NaCl, 0,2 г / л NaHCO 3, 0,05 г / л KCl, 0,2 г / л MgSO 4, 0,1 г / л CaCl 2, рН 7,0-7,5) и казеина насыщенный раствор Holtfreter и холод и до 4 ° C.
- Прикрепите сложенную Kimwipe на площади парафильмом и место на пластинчатый охладитель Пельтье или другое устройство охлаждения, расположенные под микроскопом рассечения. Пропитайте Kimwipe с охлажденной Holtfreter в растворе и место две черные прямоугольники фильтр бумаги на Kimwipe.
- Линия чашки Петри с Ватман № 2 фильтровальной бумаги. Смочите фильтровальную бумагу с решением Holtfreter и охладить посуду на лед. Для частичного облучения большие блюда и фильтр лайнер бумага может быть использована.
3. Обезболивания и иммобилизации
- Наполните чашку Петри с охлажденной решение chloretone и пипетки червей в блюдо. Для пересадки только обезболить одного хозяина и одного донора за один раз. Для частичного облучения числа (п> 10) животные могут быть под наркозом сразу.
- Позвольте червям, чтобы впитать в chloretone решение пока они не становятся неподвижными (5-10 мин).
- Промыть червей с помощью пипетки их в блюдо заполнены раствором охлажденного Holtfreter в.
- Остановите животных с помощью пипетки их на черный бумажный фильтр насыщенный раствор охлажденной Holtfreter и ориентировать их вентральной стороной вниз щипцами. Если животные способны LOCомотэ, впитывают избыток Holtfreter решение, в немного снизить температуру вашего Пельтье или холодной пластины, или увеличить длину chloretone лечения.
4. Частичные облучения
Примечание: Выполните следующие действия для подготовки животных для частичного облучения. При выполнении трансплантации вместо этого перейдите к разделу 5.
- Поместите охлажденные чашки Петри с шагом 2.7 на лед в ведерке со льдом, который будет соответствовать внутри верхнего источника рентгеновского излучателя.
- Упорядочить анестезии животных в чашке Петри, двигаясь черный фильтровальную бумагу, на которой они закреплены. Используя пинцет для перемещения под наркозом червей непосредственно может повредить им.
- Транспорт расположены животных верхней источник рентгеновского излучателя и расположить ведерко со льдом, что расстояние от катода трубки животных сведена к минимуму, при этом максимально эффективной дозы.
- Позиция свинцовый экран (ы) (рис. 1) между животными и катодом тВБО как хотелось бы. Щиты должны быть от 4,5 до 6 мм, чтобы обеспечить от 97 до 99% ослабление 325kV рентгеновского пучка 11.
- Доставка дозу рентгеновского облучения. Если полное удаление стволовых клеток из неэкранированных регионов желании поставлять в дозе 30 Гр и более использованием рентгеновского излучателя. Для сравнения, 30 Гр эквивалентно 3,6 минуты при 320 кВ и 10 мА в точности X-Ray Инк XRAD320 с полем-исток расстоянии 30 сантиметров.
- Сразу после приема завершения обработки черви черные фильтровальной бумаги, передача животных в охлажденную воду планарии. Позвольте планарии вода нагреться до комнатной температуры и животных, чтобы выбить себя из черного фильтровальной бумаги. Процедура частичного облучения завершена.
5. Трансплантации тканей
- С помощью пипетки передачи и щипцы, организовать анестезии хозяина и донора червей на отдельные прямоугольники черного фильтровальную бумагу на Kimwipe который был охлажден на шкуркиэ или холоднее пластины под микроскоп рассечения.
- Использование 0,75 мм внутреннего диаметра капилляра вырезать трансплантат вилку из доноров и с помощью пинцета, поместить его на в сторону часть хоста. Если привитой материал застревает в капиллярной трубке, выбить щипцами.
- Использование 0,7 мм наружный диаметр капилляра удалить заглушку с хозяином и с помощью щипцов позицию трансплантата в отверстие, которое осталось позади.
- Передача пересаженных хозяин на черном прямоугольнике фильтр бумагу в чашке Петри, подготовленный в шаге 2.7.
- Смочите кусочек прокатки бумаги с решением казеин насыщенных Holtfreter и поместите его на верхнюю часть пересаженных хост схематически на рисунке 2А.
- Замочите четыре части фильтровальной бумаги в насыщенный раствор казеина Holtfreter и заключите пересаженной хост схематически на рисунке 2Б.
- Замочите четыре пачки разреза Kimwipe в насыщенный раствор казеина Holtfreter и положите их нафильтровальная бумага с шагом 5.6 (рис. 2В). Замените крышку и поставил чашку Петри на льду.
- Передача доноров червей планарий в воде, чтобы оправиться, лечить и восстанавливать.
- Когда все пересадки будут завершены, разместить пересаженных червей на 10 ° C инкубатор ночь.
- На следующее утро, стараясь не нарушить трансплантата, обнаружить червя и передать его (на черном фильтровальной бумаги) в чашке Петри наполненный водой планарии.
- Либо позволить червь выбить себя из фильтровальной бумаги или аккуратно удалить пинцетом.
- Изменение планарии воды раз в 2-3 дней.
6. Представитель Результаты
Сразу же после частичного облучения планарии появится нормальный и не влияет. В зависимости от введенной дозы и геометрии щит используется, облученной ткани может регрессировать и даже распадаются 7. Экранированный ткани должны оставаться нетронутыми. Фолляблагодаря регрессии ткани и потере целостности тканей, бластемы образуют структуры и пропавших без вести будут восстановлены (рис. 3А). Если ампутация производится в частично облученные области, облученных тканей будет спасен (т.е. помешали регресс или распадающейся) (рис. 3В). В обоих неповрежденной и ампутировали случае регенерация будет отложено, по сравнению с ампутированной необлученных планарии (рис. 3). Если дозу рентгеновского облучения в дозе 30 Гр была поставлена и частично облученных животных была неповрежденной, успешное удаление стволовых клеток в образце, соответствующих ведущим щит использовали могут быть подтверждены 2 до 3 дней после частичного облучения в гибридизация для стволовых клеток Маркер SMED-Piwi-1 12 (ака smedwi-1) (рис. 4).
Утром после трансплантации, успешный трансплантата из пересаженной ткани должно быть очевидно, Within ткани хозяина, привязав как спинной и брюшной поверхности хозяина (рис. 5а). Иногда, взяточничество будет придерживаться только передние или задние поверхности. Если трансплантация была полностью неудачной, никаких признаков трансплантат будет виден из любой спинной и брюшной поверхности хозяина (рис. 5б). Вскоре после успешного трансплантат из необлученных тканей в хозяина, которая была удалена из стволовых клеток летального облучения 13,14, в гибридизация для SMED-Piwi-1 показали, что стволовые клетки присутствуют в основном в трансплантат (Рис. 5C ). Кроме того, успешные пересадки необлученных тканей в летально облученных узлов приведет к спасению тканей хозяина и выживания в долгосрочной перспективе принимающей 15.
Рисунок 1. Общее расположение основных компонентовс частичной облучения. В рентгеновского излучателя с верхней расположен источник рентгеновского излучения (катод трубки) планарий под наркозом расположена непосредственно под источником рентгеновского излучения в пределах поля облучения. В целях максимального рентгеновского дозы, расстояние между планарии и источник рентгеновского излучения должны быть минимизированы. Свинцовый экран должен быть расположен между трубой катода и под наркозом червя, как можно ближе к червь, как практический. Свинцовой защиты должны быть разработаны, изготовлены и расположены так, что он защищает желаемой ткани, но полностью раскрывает остальных червя. Многие коммерческие производители будут производить пользовательские щита провод от простой схемы разработки, и мы успешно использовали Альфа системы корпорации (Bluffdale, UT). Ведущий должен быть достаточно толстым, чтобы обеспечить нужное количество экранирования. Например, если почти полное экранирование 320 кВ рентгеновского луча желательно, ведущего должно быть от 4,5 до 6 мм. Планарии и щитом расположены нафильтровальная бумага пропитанная Holtfreter, выровненный чашки Петри, которая опирается в ведерке со льдом. Учитывая достаточно большой рентгеновский поле облучения, а также ряд одинаковых щитов свинца, многие образцы могут быть частично облученных в одно время (не показан).
Рисунок 2. Строительство восстановления камеры. (A) в разобранном виде восстановления камеры трансплантации тканей, с указанием всех компонентов, которые накладываются друг на друга после того, пропитанной казеин насыщенный раствор Holtfreter в. (B) почти завершена восстановления камеры, иллюстрирующие блокировки размещения Ватман № 3 фильтра прямоугольники бумаги, плотно закрывать анестезии планарии, препятствуя движению во время заживления. Тщательный строительство восстановления камеры предотвращает перемещение животных и высыхания, способствуя быстрому заживлению и большей эффективности трансплантации тканей.
Рисунок 3. Представитель результаты простых задних частичного облучения. Как Дюбуа описал 7, (А), когда в задней половине планарий были защищены со свинцом и затем подвергается рентгеновского облучения передней ткани наблюдается регресс к границе между облученным и экранированным ткани, при котором точки непигментированных бластемы образуются и животные начали восстанавливаться. (B) С другой стороны, когда животные были обезглавлены в том же частичное облучение проводится в (A), ткани регрессии не наблюдалось, а остальные облученных тканей передней был спасен. Обезглавлены частично облученных животных регенерировать головы (B), однако, регенерация со значительной задержкой по сравнению с необлученным обезглавленное контроля (С).
Рисунок 4. Представитель outcoМне частичного удаления стволовых клеток после частичного облучения. Всего монтажа в гибридизация (желание) для маркера стволовых клеток SMED-Piwi-1 показывает, что дикие планарии тип стволовых клеток, были распространены по всей их тела, за исключением тканей впереди фоторецепторов (стрелки) и глотки собственных (звездочка) 14. (A) ЖЕЛАЕМ для SMED-Piwi-1 в облученных, но полностью экранированы контроль планарии фиксированной три дня после облучения показывает распределение стволовых клеток, что не отличается от дикого типа планарии. (B) С другой стороны, желание стать SMED-Piwi-1 у животных, которые были лишь частично экранированы, в результате чего передняя и задняя подвергается, но были также исправлены три дня после облучения показывает, что стволовые клетки удалена из неэкранированных регионах . Масштаб баров 500 мкм.
Рисунок 5. Examples удачных и неудачных тканей. (A) изображения в реальном времени спинной и брюшной виды успешно пересадили планарии трех дней после трансплантации. Трансплантата (указано) отчетливо видна как на спинной и брюшной поверхности и окружен с характерным непигментированных ткани на трансплантат хост-интерфейс. (Б) Соответственно, неудачная трансплантация не отображать видимые ткани трансплантата на месте трансплантации (указанных) и вместо того, чтобы показать, исцелил, непигментированных, боковые раны после неудачной трансплантации. Трансплантат, который придерживается только спинной или брюшной поверхности может напоминать успешной трансплантации (A), если смотреть с одной стороны и неудачной трансплантации (B), если смотреть с другой. (C) Когда дикого типа (WT) тканей привитых в облученных хоста, которая была удалена резидентов стволовые клетки и пересаженные стволовые клетки позже выяснилось, по желанию для SMED-Piwi-1 через два дня после трансплантации,Успех трансплантации четко отображаются конкретные присутствие стволовых клеток только в пределах и вокруг трансплантата место (наконечники стрел). Масштаб баров 500 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важность иммобилизации
Иммобилизация на сегодняшний день является наиболее важным шагом для успешного завершения любой из этих процессов. Если планарии неправильно иммобилизованных до частичного облучения, они могут двигаться под свинцовый экран, производя непоследовательной и смешанные результаты. Кроме того, если животные недостаточно иммобилизованных после трансплантации, принимающих червь, скорее всего, отказаться от привитой ткани, что приводит к недостаточности трансплантата лечить должным образом на хосте. Правильная иммобилизация достигается путем изменения концентрации и продолжительности лечения и chloretone температуры и влажности в фильтровальную бумагу, на которой остальные планарии. Chloretone лечения на 0,2 процента до полутора часов, кажется, не является токсичным, однако, лечение, длина которого может вызвать выброс глотки. Планарии остаются еще и поддаются частичного облучения в течение этого периода времени. Наш опыт показывает, чтовлаги, а не лечение chloretone, является наиболее важным фактором - слишком влажным и животных, легко двигаться, слишком сухой и животных высушиванию. Во всех случаях фильтровальная бумага должна быть полностью насыщен, но не к месту создания стоячей воды в контейнере или на поверхности. Избыток жидкости может быть поколеблено в чашке Петри. Количество жидкости, используемой для пропитки фильтровальной бумаги, несомненно, должны быть скорректированы в зависимости от конкретной влажности окружающей среды.
Скорость трансплантации
Скорость имеет важное значение в повышении эффективности и частичного облучения и трансплантации. Чем дольше частично облученных животных иммобилизованных больше шансов на травму или казенную в целостности тканей которые могут исказить результаты конкретного анализа. Скорость, с которой трансплантации предварительно отформованных примерно коррелирует с успешным скорость трансплантата. Если отверстие в компьютере, чтобы получить трансплантат остается пустымСлишком долго, раненых брюшной и спинной поверхности начнут лечить друг друга, а не на трансплантат тканях, в результате неудачной трансплантации. В наших руках, взяточничество плагин лишь изредка становится подал в капиллярной трубке. В тех случаях, разъем обычно можно быстро вытеснили с мелким пинцетом или нагнетания воздуха через капилляр в рот. Как только человек становится практике с процедурой трансплантации, время, необходимое для производства многих привитых животных может быть значительно сокращена по анестезии следующий доноров, в то время как множество пар прививки предыдущей пары. Выполняя обезболивания и трансплантации одновременно, фактическое время, необходимое для производства каждого привитого животного может снизиться до всего лишь пять минут.
Универсальность частичного облучения и трансплантации
Как только условия для обезболивания и частичного облучения оптимизированы в зависимости от конкретных экспериментальных environmeП и имеющиеся рентгеновского излучателя, число различных экспериментов, которые могут быть выполнены с использованием частичного облучения техники становится больше. Расширенный свинца методы обработки позволяют для производства не только сложные щита облучение, которое может ориентироваться на конкретные органы и ткани, а также производство большого количества одинаковых щитов, что позволяет быстро создавать множество биологических повторяет. Будущие исследования, несомненно, воспользоваться этим методом для тестирования в естественных клеточных реакций на локализованных абляции стволовых клеток и функциональные различия между стволовыми клетками популяции присутствуют в различных частях планарии. Универсальность частичного облучения, как она относится к научным вопрос, представляющий интерес, ограничивается только токоподвода обработки техники и воображение. Таким образом, истинная сила частичной техникой облучения может заключаться в способности точно защитить и удалять практически любые по-разному располагатьсясубпопуляции стволовых клеток.
В то время как трансплантация позволяет для выделения субпопуляции стволовых клеток, более существенным преимуществом этого метода является возможность дифференцированно относиться к хост или донора до трансплантации. Лечение хоста или донора с наркотиками или РНК-интерференции, позволит исследование того, как необработанные пересаженные клетки ведут себя в окружающей среде или рассматриваться как обработанные клетки ведут себя в необработанной среде. Такого рода эксперименты, безусловно, поможет дразнить кроме автономных и неавтономных молекулярной вклад в функции стволовых клеток.
Кроме того, в качестве классического прививки эксперименты в планарии уже показали, 5,6, тканей является идеальной техникой для изучения индуктивных потенциал различных тканей во время регенерации. Как планарии исследование входит в молекулярную возраста, мы начали открывать очень конкретные локализованные выражение импortant сигнальных молекул, которые непосредственно контролировать восстановление 16. Пересадка тканей, которые содержат эти сигнальные молекулы к внематочной сайтов во время регенерации может помочь нам лучше понять их роль в управлении морфогенеза структур регенерации.
Преимущества частичного облучения и тканей по сравнению с другими методами
Кроме того, присущих конкретной силы, что частичное облучение и тканей имеют по сравнению друг с другом, они также предоставляют определенные преимущества по сравнению с другими методами, планарии поле регенерации. Например, низкие дозы облучения был использован как способ выделить небольшое количество стволовых клеток в противном случае стволовых клеток, лишенных хозяин 4,17, однако, поскольку мы не знаем, как сублетальных облучение влияет на стволовые клетки планарии, мы не можем быть уверены, о том, что сотовые поведение наблюдается в этих экспериментах, характерно нормальное.Это предостережение низкой дозы облучения составляет меньше беспокойства в частных облучения из-за радиационного воздействия могут быть легко ослабленный более чем на 99 процентов, провод нужной толщины. Кроме того, трансплантация полностью избежать этой оговоркой, потому что небольшая популяция стволовых клеток может быть выделен в стволовые клетки лишенный хозяин никогда не подвергая трансплантированных клеток к радиации. Кроме того, точное положение здоровые стволовые клетки могут быть известны и управляются как частичный облучения и трансплантации, в то время как клетки выжить низкая доза облучения расположены случайно во всем животным. Наконец, в то время как одна трансплантация ячейки элегантно продемонстрировал высокий потенциал одной стволовой клетки планарии 4, тканей может оказаться столь же мощную технику, потому что это быстрее и менее утомительно, и функции и поведение количество клеток можно наблюдать одновременно в каждом узле. Анализ небольшой популяции клетокпо сравнению с одной ячейки позволяет не только более эффективного сбора данных, но это может также свидетельствовать межклеточных взаимодействий, которые будут пропущены в одном тесте клеточной трансплантации.
Заключение
Частичные облучения и тканей, хотя старые методы, будет играть важную роль в рассекает функции стволовых клеток планарий, а также общие молекулярные механизмы, лежащие в основе регенерации. Модернизация этих классических методов привел более высокой пропускной способности и большей согласованности при этом возможности для интеграции современных функциональных тестов и молекулярных методов. Эти классические методы, которые были когда-то наметить основные вопросы регенерации планарии теперь может быть использовано для получения ответов на эти вопросы и, следовательно, дальнейшее наше понимание биологии стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Chiyoko Кобаяси и Kiyokazu Агата полезные советы по трансплантации планарий, а также прошлых и настоящих членов Санчес лаборатории за неоценимую обсуждения в ходе развития этих технологий. Эта работа была поддержана NIH обучения Грант (5T32 HD0791), чтобы КГК и NIH R37GM057260 в ASA. ASA является Медицинского института Говарда Хьюза следователь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 | |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 | |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 | |
| Black filter paper | Schleicher Schuell | 10310809 | |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B | |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E | |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA | |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 | |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 | |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 | |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 | |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design | |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A.
- Randolph, H.
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F.
- Morgan, L.
- Dubois, F. Contribution á l 'ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
