Summary
אנו מתארים את הכנת גורם תא T צמיחה המשמש הרחבה של מבחנה של אנטיגן ספציפי לערמונית קווי עכברוש T לימפוציטים.
Abstract
תחזוקה של אנטיגן ספציפי לערמונית T שורות תאים או שיבוטים בתרבות דורש הפעלת סיבובים של אנטיגן-Induced מופרדות שלבי 1,2 הרחבת התא. תוספת של אינטרלוקין 2 לתקשורת התרבות בשלב ההתרחבות נחוצה כדי למנוע מוות של תאים ו מספיק כדי לשמור לטווח קצר שורות תאים T אבל הוכח להגדיל Th1 קיטוב 3. החלפה של אינטרלוקין 2 בפקטור תא T צמיחה (TCGF) אשר מכיל תערובת של ציטוקינים הוא יעיל יותר מאשר אינטרלוקין 2 בשמירה לטווח ארוך שורות תאים T במבחנה 3. יתר על כן, TCGF יכול בקלות להיות מוכנים בכמויות גדולות במעבדה, והוא הרבה יותר זול מאשר רקומביננטי אינטרלוקין 2.
כאן, אנו מראים כיצד להכין TCGF מ supernatants עכברוש splenocyte תרבות. במשך התהליך הזה, שאנחנו קוצרים spleens מ נאיבי חולדות לואיס מורדמים עבור התימוס ואיסוף הדם. אנחנו מכינים תא בודד השעיות מן spleens, lyze את כדוריות הדם האדומות של הלם אוסמוטי, ואת הזרע splenocytes במדיום תרבות. התאים מגורה עם concanavalin, mitogen כי הלא סלקטיבי מפעיל כל T לימפוציטים עכברוש, וישכנע את הייצור של ציטוקינים. Supernantant תרבות נאסף 48 שעות לאחר מכן concanavalin andexcess חייב mannoside מתיל אלפא כדי למנוע את הפעלת הקווים תא T אשר TCGF יתווספו. TCGF אז הוא סטרילי, מסונן, aliquoted, ומאוחסנים ב -20 ° C.
Protocol
- קח spleens לואיס חולדה (חולדות בין 160-200 הם הטובים ביותר). Dilacerate על קרח בצלחת פטרי המכילות PBS + אנטיביוטיקה (PBS-PS) בעזרת מסננת התא. שים בתוך שפופרת 50 מ"ל. מלא עם PBS-PS.
- ספין של 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
- לשטוף את התאים פעמיים.
- Resuspend גלולה ב NH 4 Cl 0.15 מ '(5 מ"ל לכל טחול). מערבבים בעדינות עם pipet ברציפות למשך 3 דק 'על קרח lyse אריתרוציטים. מלאו את הצינור עם המדיום.
- ספין של 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
- לשטוף את התאים פעמיים.
- ספירת התאים. הטחול עכברוש נותן 200-250000000 תאים.
- זרעים התאים ב -2 מיליון דולר מ"ל במדיום שלם: 50 מ"ל לכל בקבוק 75 ס"מ 2.
- תנו לגדול במשך 48 שעות בחממה.
- ספין 15 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
- אסוף את supernatant; להשליך את התאים.
- הוסף 15 מ"ג / מ"ל mannoside מתיל אל supernatant. מערבבים היטב.
- מסנן (0.2 מ"מ)
- Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 ימים במקרה הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו מכינים TCGF מ splenocytes לואיס עכברוש מאז שאנחנו בקביעות להרדים חולדות נאיבי מהמאמץ הזה לקצור בסרום thymi לעורר לואיס עכברוש T שורות תאים במבחנה. TCGF זה יכול לשמש כדי לקדם את הצמיחה ואת ההישרדות של שורות תאים T מ זני עכברים אחרים. TCGF יכול גם להיות מוכנים מן זנים אחרים של חולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
| Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
| Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma-Aldrich | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Heat-inactivated |
| Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
| RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | R7256 | |
| Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A. | ||||
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
