Denne metode beskriver hvordan du isolerer og udødeliggøre mikrovaskulære endotelceller fra musehjerne. Vi beskriver en trin-for-trin-protokollen begyndende fra homogenisering af hjernevævet, fordøjelse trin, podning og immortalisering af cellerne. Normalt vil det tage omkring fem uger for at opnå en homogen, immortaliseret mikrovaskulære endotel-cellelinie.
Epitel-og endotelceller (EF) bygger paracellulær barrierer, som beskytter væv fra det eksterne og interne miljø. Blod-hjerne-barrieren (BBB), der består af EF, astrocyt endelige fødder, pericytter og basalmembranen er ansvarlig for beskyttelse og homeostase af hjernen parenkym. In vitro BBB modeller er fælles værktøjer til at studere struktur og funktion af BBB på celleniveau. Et betydeligt antal af forskellige in vitro-BBB-modeller er blevet oprettet til forskning i forskellige laboratorier til dato. Normalt er cellerne opnået fra kvæg, svin, rotte eller mus hjernevæv (beskrevet nærmere i gennemgangen af Wilhelm et al. 1). Menneskelige vævsprøver er kun tilgængelige i et begrænset antal laboratorier eller virksomheder 2,3. Mens primære cellepræparater er tidskrævende og EF kulturer kan variere fra parti til parti, etablering af udødeliggjorte EF lines er i fokus for videnskabelig interesse.
Her præsenteres en metode til oprettelse af en udødeliggjort hjerne mikrovaskulære EF linje fra neonatal musehjerne. Vi beskriver den procedure trin-for-trin notering på reagenser og løsninger anvendes. Fremgangsmåden indført ved vores laboratorium tillader isolering af en homogen immortaliseret endothelial cellelinie inden for fire til fem uger. Hjernen mikrovaskulære endotelceller cellelinier betegnet cEND 4 (fra cerebral cortex) og cerebEND 5 (fra cerebellar cortex), blev isoleret ifølge denne fremgangsmåde i Förster laboratoriet og er blevet effektivt anvendt til forklaring af forskellige fysiologiske og patologiske processer i BBB. Ved hjælp cEND og cerebEND vi har vist, at disse celler responderer på glucocorticoid-4,6-9 og østrogen-treatment 10 samt pro-inflammatoriske mediatorer, såsom TNFalfa 5,8. Desuden har vi undersøgt patologien af multipel sclerosis 11 og hypoxi 12,13 på EF-niveau. Den cEND og cerebEND linjer kan betragtes som et godt redskab til at studere struktur og funktion af BBB, cellulære responser af ECS på forskellige stimuli eller et samspil mellem EF med lymfocytter eller kræftceller.
Den beskrevne procedure kan anvendes til isolering af mikrovaskulære ECS fra forskellige musestammer og fra forskellige knock-out musestammer at undersøge de specifikke ændringer i vaskulært endotel-funktionen. Som en fremgangsmåde til immortalisering anvendte vi transformation med oncoproteinet af murin polyomavirus, Polyoma midterste T-antigen. Det omdanner hurtigt umodne endotelceller in vivo og in vitro 20,21,22. Andre fremgangsmåder til immortalisering af EC'er beskrevet i litteraturen indbefatter for eksempel immortalisering med SV40 stort T-antigen fra Simian vakuolerende Virus 40 23, adenovirus genprodukt E1A 24 eller overekspression af den katalytiske underenhed af human telomerase 3. The immortalisering med PyMT er specifikt for den murine umodne EC'er, der tillader opnåelse af en homogen EF kultur fra neonatale mus på kort tid. Immortalisering ændrer egenskaberne af celler og the resultater opnået med immortaliserede cellelinjer bør sammenlignes med enten primære celler eller eksperimenter in vivo med mus. PyMT udødeliggjort EF er blevet beskrevet at udtrykke høje niveauer af fibrinolytisk aktivitet som følge af forøget produktion af urokinase-plasminogenaktivator og nedsat produktion af plasminogenaktivatorinhibitorer 25. Direkte sammenligning af PyMT udødeliggjort bEND5 cellelinie med primær EC'er afslørede, at både in vitro BBB-modeller er velegnede til T-celle-adhæsion studier 26.
De cellelinjer etableret ifølge den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes ved lav passage for at bibeholde barriereegenskaber ved høj ekspression af BBB og EF forbindelsesepitoper proteiner, som celler mister disse egenskaber under ældning. Således efter tab af barriereegenskaber, skal fremstillingen af en ny cellelinie overvejes. Cell udpladningsdensitet bør være høj for EC'er, da dette er kritisk for celleproliferation. Dette skal ses under isoleringsproceduren samt vedligeholdelse af den udødeliggjorte ECS. Hver ny cellelinie bør testes for dens barriereegenskaber og for mulig forurening med andre celletyper. EF monolag kan farvet med anti-galactocerebrosid, anti-glia-fibrillært surt protein og anti-glat muskulatur antigen som primære antistoffer for at udelukke kontaminering med oligodendrocytter, astrocytter og pericytter 4,27. At udelukke kontaminering med meningal vaskulatur, kan ekspressionen af thrombomodulin testes, som udtrykkes i alle kar med undtagelse af hjernen 28.
Interessant nok immortaliserede mikrovaskulære endotelceller cellelinier isoleret fra forskellige hjerneområder forskellige i deres barriereegenskaber og modtagelighed for proinflammatoriske stimuli. Som et eksempel kan de cerebrale cEND og cerebellar cerebEND cellelinier nævnes 4,5. CerebEND viste, i sammenligningat cEND, lavere ekspressionsniveauer af større tight junction komponenter claudin-1 og occludin. Men niveauet af claudin-3 og -12 var højere i cerebEND. Barrierefunktionen af cerebEND celler lidt mere under en behandling med inflammatorisk mediator, TNFa end barriereegenskaberne af cEND celler gjorde 5. Højere cerebellar sårbarhed over for inflammatoriske stimuli, kan observeres in vivo i patienter med dissemineret sklerose og i dyremodel eksperimentel autoimmun encephalomyelitis 29. Disse interessante resultater viser nødvendigheden af at generere og karakterisering af individuelle in vitro modeller for de forskellige hjerneregioner, for at forbedre den fremtidige lægemiddelmålretning ind i hjernen.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG under tilskud nummer FO 315/4-1 og DFG SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |