Cette méthode décrit comment isoler et d'immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l'homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l'ensemencement et l'immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.
Les cellules épithéliales et endothéliales (CE) sont la construction de barrières paracellulaires qui protègent le tissu de l'environnement externe et interne. La barrière hémato-encéphalique (BHE) constituée des CE, astrocytes finaux pieds, péricytes et la membrane basale est responsable de la protection et de l'homéostasie du parenchyme cérébral. Dans les modèles in vitro BBB sont des outils communs pour étudier la structure et la fonction de la BHE au niveau cellulaire. Un nombre considérable de différents modèles in vitro BBB ont été établis pour la recherche dans différents laboratoires à ce jour. Habituellement, les cellules sont obtenues à partir de bovins, porcins, les tissus du cerveau de rat ou de la souris (examinée en détail dans la revue de Wilhelm et al. 1). Échantillons de tissus humains ne sont disponibles que dans un nombre restreint de laboratoires ou d'entreprises 2,3. Alors que les préparatifs de cellules primaires prennent du temps et les cultures communautaires peuvent varier d'un lot à l'autre, la mise en place d'immortalisé CE lines est le centre d'intérêt scientifique.
Ici, nous présentons une méthode pour établir un cerveau immortalisé endothéliales des microvaisseaux du cerveau de souris en ligne néonatale. Nous décrivons la procédure étape par étape, la liste des réactifs et des solutions utilisées. La méthode établie par notre laboratoire permet l'isolement d'une ligne homogène de cellules immortalisées endothéliales dans les quatre à cinq semaines. Les lignes de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau appelée Cend 4 (à partir de cortex cérébral) et cerebEND 5 (à partir de cortex cérébelleux), ont été isolées selon cette procédure dans le laboratoire Förster et ont été effectivement utilisés pour l'explication des différents processus physiologiques et pathologiques au Bureau. Utilisation Cend et cerebEND nous avons démontré que ces cellules répondent aux glucocorticoïdes et d'oestrogènes 4,6-9-traitement 10 ainsi que de pro-infammatory médiateurs, comme le TNFalpha 5,8. En outre, nous avons étudié la pathologie de multiples sclerosis 11 et 12,13 hypoxie sur l'échelon communautaire. Le Cend et lignes cerebEND peut être considéré comme un bon outil pour étudier la structure et la fonction de la BHE, les réponses cellulaires d'ECS à différents stimuli ou de l'interaction de la CE avec des lymphocytes ou des cellules cancéreuses.
La procédure décrite peut être utilisée pour l'isolement de complications microvasculaires ECs à partir de souches de souris différentes, ainsi que de différentes souches de souris knock-out pour étudier les changements spécifiques dans la fonction endothéliale vasculaire. En tant que méthode d'immortalisation, nous avons utilisé la transformation avec des polyomavirus murin oncoprotéine, Polyome moyen T antigène. Il se transforme rapidement immatures cellules endothéliales in vivo et in vitro 20,21,22. D'autres méthodes d'immortalisation des contraceptifs d'urgence décrites dans la littérature comprennent par exemple l'immortalisation avec antigène T de SV40 grand nombre de virus simien vacuolisante 40 23, produit du gène E1A d'adénovirus 24 ou la surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase humaine 3. L'immortalisation avec PyMT est spécifique pour le murin EC immatures, ce qui permet d'obtenir une culture homogène CE de souriceaux nouveau-nés dans un court laps de temps. Modifie les propriétés immortalisation des cellules et eles résultats obtenus avec e lignées cellulaires immortalisées devraient être comparés soit avec des cellules primaires ou à des expériences in vivo sur des souris. PyMT immortalisé CE a été décrit pour exprimer des niveaux élevés d'activité fibrinolytique accrue résultant de la production de l'urokinase-type plasminogen activator et une diminution de la production d'inhibiteurs de l'activateur du plasminogène 25. La comparaison directe des PyMT immortalisé bEND5 lignée cellulaire avec primaire ECs a révélé que dans les modèles in vitro BBB sont bien adaptés pour les études d'adhérence cellulaire T 26.
Les lignées cellulaires établies conformément à la procédure décrite peut être utilisée au nombre de passages bas afin de maintenir les propriétés de barrière par une expression élevée de protéines BBB et CE de jonction, comme les cellules perdent ces propriétés au cours du vieillissement. Ainsi, après la perte de propriétés de barrière, la préparation d'une nouvelle lignée cellulaire doit être envisagé. Densité de placage cellule doit être élevée pour EC, car cela est essentiel pour la prolifération cellulaire. Ceci doit être pris en compte lors de la procédure d'isolement ainsi que la maintenance de la immortalisé EC. Chaque nouvelle lignée cellulaire doit être testé pour ses propriétés de barrière et de contaminants possibles avec d'autres types cellulaires. Monocouches CE peut être teinté avec l'antigène du muscle anti-galactocérébroside, anti-protéine acide fibrillaire gliale et anti-lisse comme anticorps primaires pour exclure la contamination par les oligodendrocytes, les astrocytes et les péricytes 4,27. Afin d'éliminer la contamination par les vaisseaux meningal, l'expression de la thrombomoduline peut être testée, qui est exprimée dans tous les lits vasculaires, à l'exception du cerveau 28.
Fait intéressant, les lignées immortalisées de cellules endothéliales microvasculaires isolées à partir de différentes régions du cerveau diffèrent dans leurs propriétés de barrière et la sensibilité aux stimuli pro-inflammatoires. A titre d'exemple, les cérébraux et cérébelleux Cend lignées cellulaires cerebEND peut citer 4,5. CerebEND a montré, en comparaisonà Cend, baisse des niveaux d'expression des principaux composants des jonctions serrées claudine-1 et occludine. Cependant, les niveaux de claudine-3 et -12 ont été plus élevés dans cerebEND. La fonction de barrière de cellules cerebEND beaucoup plus souffert sous un traitement avec le médiateur inflammatoire, le TNF que les propriétés de barrière de cellules Cend fait 5. Vulnérabilité supérieur du cervelet à des stimuli inflammatoires, peuvent être observés in vivo chez les patients de sclérose en plaques et dans son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto-immune 29. Ces résultats intéressants montrent la nécessité de produire et de caractérisation individuelle des modèles in vitro pour les différentes régions du cerveau, afin d'améliorer le ciblage futur médicament dans le cerveau.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été soutenue par la DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft sous numéro de subvention FO 315/4-1 et la DFG SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |