Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.
Las células epiteliales y endoteliales (CE) están creando barreras paracelulares que protegen el tejido del entorno externo e interno. La barrera sangre-cerebro (BBB) que consiste en CE, astrocitos pies finales pericitos, y la membrana basal es responsable de la protección y de la homeostasis del parénquima cerebral. En modelos in vitro BBB son herramientas comunes para estudiar la estructura y función de la BBB en el nivel celular. Un número considerable de diferentes modelos in vitro BBB se han establecido para la investigación en laboratorios diferentes hasta la fecha. Generalmente, las células se obtienen de bovino, porcino, de rata o de tejido de cerebro de ratón (discutido en detalle en la revisión por Wilhelm et al. 1). Muestras de tejidos humanos sólo están disponibles en un número limitado de laboratorios o empresas 2,3. Mientras que las preparaciones de células primarias son mucho tiempo y las culturas CE puede variar de lote a lote, el establecimiento de inmortalizada CE lines es el foco de interés científico.
A continuación, se presenta un método para establecer una línea microvascular cerebral inmortalizado CE de cerebro de ratón recién nacido. Se describe el procedimiento paso a paso lista de los reactivos y las soluciones utilizados. El método establecido por nuestro laboratorio permite el aislamiento de una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales dentro de las cuatro a cinco semanas. Las líneas de células microvasculares endoteliales del cerebro denominada CEND 4 (a partir de la corteza cerebral) y cerebEND 5 (a partir de corteza cerebelosa), se aisló de acuerdo con este procedimiento en el laboratorio Förster y se han usado eficazmente para la explicación de diferentes procesos fisiológicos y patológicos en el BBB. Uso de CEND y cerebEND hemos demostrado que estas células responden a glucocorticoides y estrógenos 4,6-9 tratamiento 10, así como a pro-infammatory mediadores, tales como TNF-alfa 5,8. Por otra parte, se ha estudiado la patología de múltiples sclerosis 11 y 12,13 hipoxia en la CE-nivel. El CEND y líneas cerebEND se puede considerar como una buena herramienta para el estudio de la estructura y función de la BHE, las respuestas celulares de los AE a diferentes estímulos o en la interacción de la CE con linfocitos o células cancerosas.
El procedimiento descrito puede ser utilizado para el aislamiento de microvascular ECs de diferentes cepas de ratón, así como a partir de diferentes cepas de ratón knock-out para estudiar los cambios específicos en la función del endotelio vascular. Como un método de inmortalización se utilizó la transformación con oncoproteína de poliomavirus murino, Polioma medio antígeno T. Se transforma rápidamente inmaduros células endoteliales in vivo e in vitro 20,21,22. Otros métodos de inmortalización de ECs descritos en la literatura incluyen, por ejemplo, la inmortalización con antígeno T grande SV40 de Simian Virus 40 23 vacuolizante, producto del gen E1A del adenovirus 24 o la sobreexpresión de la subunidad catalítica de la telomerasa humana 3. La inmortalización con PYMT es específico para el murino ECs inmaduro, que permite la obtención de un cultivo homogéneo CE de ratones neonatos en un corto tiempo. Inmortalización cambia las propiedades de las células y thE Resultados obtenidos con las líneas celulares inmortalizadas deben compararse con las células primarias o con experimentos in vivo con ratones. PYMT inmortalizada CE se ha descrito para expresar altos niveles de actividad fibrinolítica que resultan de una mayor producción de plasminógeno de tipo uroquinasa activador y disminución de la producción de activador del plasminógeno 25. La comparación directa de PYMT inmortalizada bEND5 línea celular primaria con ECs reveló que tanto en modelos in vitro BBB son muy adecuados para los estudios de adhesión de células T 26.
Las líneas celulares establecidas de acuerdo con el procedimiento descrito se puede utilizar en el paso número bajo para mantener las propiedades de barrera por la alta expresión de proteínas de BBB y CE de la unión, como las células pierden estas propiedades durante el envejecimiento. Así, después de la pérdida de propiedades de barrera, la preparación de una nueva línea celular debe ser considerado. Densidad de célula de recubrimiento debe ser alta para ECs, ya que es fundamental para la proliferación celular. Esto debe tenerse en cuenta durante el procedimiento de aislamiento así como el mantenimiento de la inmortalizada ECs. Cada línea celular nuevo deben ser evaluados por sus propiedades de barrera y de posibles contaminantes con otros tipos de células. Monocapas CE pueden ser teñidas con anti-antígeno de músculo galactocerebrósido, anti-proteína ácida fibrilar glial y anti-liso como anticuerpos primarios para excluir la contaminación con los oligodendrocitos, astrocitos y pericitos 4,27. Para descartar la contaminación por vasculatura meningal, la expresión de la trombomodulina puede ser probado, que se expresa en todos los lechos vasculares con la excepción del cerebro 28.
Curiosamente, las líneas de células endoteliales microvasculares inmortalizadas aisladas de diferentes regiones del cerebro difieren en sus propiedades de barrera y la susceptibilidad a los estímulos proinflamatorios. Como ejemplo, las líneas cerebEND CEND cerebrales y del cerebelo celulares se pueden mencionar 4,5. CerebEND mostró, en comparacióna CEND, la disminución de los niveles de expresión de los principales componentes del apretado nudo de claudina-1 y ocludina. Sin embargo, los niveles de claudin-3 y -12 fueron mayores en cerebEND. La función de barrera de las células cerebEND sufrido mucho más bajo un tratamiento con el mediador inflamatorio, TNFa que las propiedades de barrera de las células CEND hizo 5. Mayor vulnerabilidad cerebelosa a estímulos inflamatorios, se puede observar in vivo en pacientes con esclerosis múltiple y en su modelo animal experimental encefalomielitis autoinmune 29. Estos hallazgos interesantes muestran la necesidad de generación y caracterización individual en modelos in vitro para diferentes regiones del cerebro, con el fin de mejorar la focalización de medicamentos futuro en el cerebro.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por la DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft bajo el número de concesión y DFG 315/4-1 FO SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |