Summary
本协议描述成纤维细胞与低强度脉冲超声波的刺激，从而推动粘着形成和Rac1激活通过模仿跨膜基质受体，降解syndecan-4参与。这种方法允许在细胞水平上一个成功的临床技术的调查，从而提供了完善的治疗机会。
Abstract
在多细胞生物体中，细胞的行为是通过与细胞外基质的相互作用决定的。矩阵参与范围从调节细胞迁移和增殖，分泌和即使分化的后果。基本每个这些复杂的过程所产生的信号从细胞外基质受体的细胞表面分子间的相互作用。整合的原型受体与提供细胞外基质和细胞骨架之间的机械连接，以及发起的一些粘附依赖的信号转导通路。然而，它正变得越来越明显，额外的跨膜受体旁边的整合功能，调节下游的整合和信号。这些例子中最优雅的跨膜蛋白多糖，降解syndecan-4，α5β1整合与合作过程中粘附到纤维连接蛋白在体内模型demonstr吃的syndecan-4信号的重要性，作为降解syndecan-4基因敲除小鼠表现出愈合迟缓，由于低效的成纤维细胞迁移1,2。在野生型动物，所引发的纤维连接蛋白的外观，从受损的毛细血管渗漏和沉积在损伤组织巨噬细胞迁移的成纤维细胞向伤口。因此有极大的兴趣，增强纤维连接蛋白依赖的信号，并可以加快修复过程中发现战略。
纤维连接蛋白依赖的信号介导的整合和降解syndecan-4-介导的组件可以通过刺激细胞分离与重组纤维连接蛋白片段。虽然整合的参与是必不可少的细胞粘附，某些纤维连接蛋白依赖的信号受降解syndecan-4。降解syndecan-4激活Rac1的前伸的信号，使整合再分配1，触发细胞骨架分子，如纽，招聘，联络粘连，从而诱导定向迁移3。我们寻找替代战略激活这些信号，并发现，低强度脉冲超声波（LIPUS）可以模仿的syndecan-4参与的影响。在这个协议中，我们描述了30毫瓦/平方厘米 ，1.5兆赫超声波，1 kHz时（ 图1）脉冲，可应用于文化中的成纤维细胞（ 图2）诱导Rac1的激活和粘着形成的方法。超声刺激，最多为20分钟，这个参数的组合已被发现是最有效的加速临床骨折修复6。该方法采用重组纤维连接蛋白片段进行α5β1整合，没有参与的syndecan-4，需要由放线菌酮抑制蛋白质的合成，阻止成纤维细胞额外的基质沉积。，Ø积极作用f在修复机制的超声是有据可查的7,8，了解文化的超声分子的影响，我们应该能够改进治疗技术，以提高临床疗效。
Protocol
1。涂层表面与基体的配体
- 将超声波应用于细胞在3.5厘米的水井，无论是作为个人的菜肴，或作为一个6孔板。生化检测，直接将塑料外套配。免疫，熬盖玻片三次MilliQ水和4盖玻片放入每口井的底部。
- 必须是衍生的玻璃表面，以确保有效的配体涂层。磺-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide在PBS酯溶解在1毫米。加入2毫升，每口井和30分钟，在室温下孵育。
- 用PBS洗衍生表面的3倍。
- 大衣或者衍生的玻璃或未经处理的塑料与整合配。每口井，适用于2毫升10微克/毫升整合ligand9，溶解在含Ca 2 +，Mg 2 +的 PBS过夜孵育在4°C。
- 加热1％BSA的PBS溶解，85℃，13分钟准备monoparticulate BSA的。允许冷却，然后通过0.45微米的过滤器。
- 配体涂层表面洗净与30分钟monoparticulate的BSA的PBS和块的3倍。
2。单元的制备
- 要控制整个实验的基质环境，应阻止蛋白质的合成增加25微克/毫升放线菌酮80％融合成纤维细胞为2小时。
- 放线菌酮处理的细胞，用PBS冲洗脱离文化瓶使用0.5 mg / ml的胰蛋白酶/ EDTA。
- 500XĞ离心5分钟，离体细胞收获。
- 重悬细胞在DMEM/25毫米肝素钠，25微克/毫升放线菌酮。
- 暂停使用血球计数细胞密度，并稀释至105毫升，1。
- 在37°C孵育20分钟的时间来恢复表面整合的细胞。
- 冲洗配体涂层，牛血清白蛋白封闭的井用PBS 3倍。
- 种子2毫升细胞悬液，将每口井。
- 异体瓦特细胞散布在2小时37℃，5％的CO 2。
3。超声波刺激
- 温暖超声波发射器阵列和耦合凝胶至37°C。
- 应用到每个发射器的耦合凝胶豌豆大小的BLOB。
- 测试使用超声指标二极管探测器，每个发射器的功能。
- 将发射阵列上井。返回数组到37°C，5％的CO 2，允许温度平衡10分钟。
- 对超声信号的切换。
- 超声波信号将关闭20分钟后，模仿治疗制度。如果需要刺激时间较短，板应该从数组中删除在适当的时间点。在所有情况下使用无刺激板块作为阴性对照。
4。免疫荧光粘着分析
- 粘着形成的分析，适用于20分钟的超声波信号然后让细胞保持在37℃，5％CO 2的结构，以发展为40分钟。
- 吸媒体和修复细胞，用2毫升4％多聚甲醛的PBS。在室温下孵育14分钟。
- 吸聚甲醛，并用PBS冲洗3次，申请下来的PBS以及边缘轻轻地避免产生剪切力。
- 每个盖玻片转移以及从3.5厘米到24孔板为随后的免疫荧光染色。
- 淬火残留多聚甲醛PBS 0.5毫升0.1 M甘氨酸应用24口井，每年。在室温20分钟孵育。
- 吸出甘氨酸，用PBS冲洗三次。
- Permeabilise用0.5毫升0.5％的Triton X-100（W / V）在PBS的细胞。在室温下孵育4分钟。
- 分泌物的Triton X-100，用PBS冲洗三次。
- 用3毫升0.5％（W / V），在PBS BSA的封锁。 4＆D孵育过夜例如，C。
- 染色纽HVIN-1 BSA的块1:400稀释抗体含有粘着。在室温下孵育一小时。
- 用PBS冲洗3次。
- 应用荧光标记的二抗（1:200稀释）和TRITC标记的鬼笔环肽（1:200稀释）在BSA块肌动蛋白染色，（DyLight 488）。在室温30分钟孵育。
- PBS和一次水冲洗三次。
- 上玻片安装在一个倒置的使用延长金奖mountant的位置。
5。量化Rac1的激活下拉含量
- Rac1的活化分析，适用于20分钟的超声波信号到细胞在37℃，5％CO 2。评估的响应时间超过20分钟时，申请了20分钟的超声波信号，并保持细胞在37℃，5％CO 2剩余时间允许响应发展。
- 抽吸媒体和地方以及S的冰。 2毫升冷PBS和吸冲洗井。确保任何残留的PBS离开1分钟后彻底抽吸倾斜的井被删除。
- 裂解细胞在冰上35μL裂解液（10％甘油，20毫米HEPES pH值7.4，140 mM氯化钠，1％NP40，0.5％去氧胆酸钠，EGTA 4毫米，4毫米EDTA，1×完整的蛋白酶抑制剂），每口井。在这个例子中，6口井，每时间点生成细胞裂解液210μL。可以使用更多或更少的井，但总裂解液量应占〜200μL。
- 刮细胞与细胞刮刀彻底，以确保完整的细胞裂解和离开井倾斜1分钟，允许裂解池。
- 转移裂解物到一个冰冰冷的1.5毫升离心管（池同等待遇制度裂解）和自旋在21000×G 2分钟，在4°C颗粒细胞碎片。
- 180μL裂解液转移到冰冷的1.5 ml离心管含有130μL裂解液和25μLPAK-过剩athione琼脂糖珠10。随后凝胶分离，保持在-20°C的剩余原油裂解。
- 捕捉PAK-谷胱甘肽琼脂糖珠的积极Rac1的旋转管时间为40分钟，在4°C。
- 收获琼脂糖珠偶联于2000年通过离心1分钟×4Ğ°C。
- 洗珠偶联用500μl裂解液三次，每次冲洗后收获2000X g和丢弃上清液离心珠。小心地取出200μL移液器任何剩余的溶解洗涤缓冲。
- 洗脱每个样品35μL的SDS-PAGE上样缓冲液孵育85°C间为5分钟，加入上晃动热块。在21000×g下离心1分钟，取出的珠子。
- 通过SDS-PAGE解决珠洗脱液，转移至硝酸纤维素和Rac1的探头。
6。代表结果
在这个协议中，我们描述了感应纽染色编辑粘着超声和Rac1活动。粘着实验的基线位置是成纤维细胞上配体α5β1 -整合传播没有形成，除非第二个降解syndecan-4，纤维连接蛋白受体，纽含粘连（ 图3A），此外，从事可溶性配体（ 图3B）3,4。然而，用超声波刺激诱 导粘着形成的syndecan-4（ 图3C）参与相同的程度，表明，超声波刺激可以代替某些部件的纤维连接蛋白依赖的信号通路5。这个协议的主要障碍消除粘着在兴奋剂的情况下形成的。由放线菌酮抑制蛋白质合成的不完整，将允许自动刺激细胞是足够的基质沉积。细胞过度拥挤，也可导致低级别的粘着formation和细胞 - 细胞和细胞外基质的接触之间的串扰超声反应不佳将复杂的实验，旨在孤立单一的刺激。作为一个发展的基本实验中，我们表现出同样的实验，反复降解syndecan-4（ 图4）成纤维细胞与缺乏。这些成纤维细胞仍然响应超声（ 图4C），但未能作出回应降解syndecan-4配体（ 图4B）。使用Sdc4 - / -成纤维细胞的实验表明，超声波的确可以绕过某些纤维连接蛋白受体的需要，并演示了如何简单的协议，可以开发，以获得有关的信号通路的额外信息。
我们的生化实验表明，超声波可诱导Rac1的激活，使用下拉检测，德尔波索等 10所描述的方法是适应。 Rac1的活性0，10，30和60分钟后，INI降水超声刺激tiation显示，Rac1的活性峰在10-30分钟，然后再返回到基线（ 图5）。纽原油裂解印迹确保时间点之间的等效负载。结果类似于Rac1的激活参与降解syndecan-4 3，但略多于长期激活纤维连接蛋白。因此，通常需要8-10个重复，以实现重要数据。 Rac1的激活是细胞粘着形成的承诺负责，新生粘着开始形成10-30分钟，正好与Rac1的激活。一旦启动，这些粘连会继续成熟，变成大斑块粘附在图3和图4所示。
图1。超声波的形式。超声包括间歇性的1.5 MHz信号，由于低振幅（30毫瓦/厘米<SUP> 2，空间平均时间平均），有没有供暖效果。
图2。用超声波细胞的制备和刺激的工作流程示意图表示。
图3。超声诱导成纤维细胞粘着形成。成纤维细胞上的整合纤维连接蛋白结合片段刺激纤维连接蛋白降解syndecan-4-结合片段（B）或超声（三）前（一）传播。 60分钟的刺激之后，细胞固定，纽蛋白和肌动蛋白染色，萤光成像。酒吧= 10微米。
图4。缺乏降解syndecan-4的成纤维细胞粘着形成的超声诱导。
图5。超声Rac1的激活。刺激细胞6口井，每时间点为0，10，30和60分钟。 GTP-Rac1的样品目前的金额从Rac1的下拉检测时间当然是可视化的孵化与反Rac1蛋白抗体上的印迹（顶端图像）。带的强度（平均8-10复制）量化揭示增加Rac1的1ctivity产生超声波信号，在10和30分钟，在60分钟（图），然后返回到基线水平。误差棒代表SEM
Discussion
在这个协议中，我们描述了可以在基于细胞的实验中使用的方法，通常应用于人类患者的治疗。最终的目标是可以提炼治疗的分子机制，使了解超声波行动的。在这个协议中，我们使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为细胞模型系统，但超声也已被发现在人包皮成纤维细胞的主要5，间质干细胞，成骨细胞和软骨细胞6有效。我们用一个例子生化检测Rac1的激活，但同样的方法可以用来测试调节蛋白磷酸化或通过免疫蛋白复合物的形成。为免疫的例子，我们证明上粘着形成的影响超声，但可以审查任何分子的再分配。例如，可以测试的细胞膜，细胞质因素招聘蛋白酶colocalisation插件贩运囊泡或超声检查对有丝分裂纺锤体组织的影响。到目前为止，我们只限于自己来测试纤维连接蛋白依赖性途径，通过超声波对细胞的影响，胶原蛋白，或生长因子的存在，可以测试超声在复杂的环境影响细胞的行为如何建立一个图片类似于在体内的情况。一个更大的挑战将是检验超声使用时间推移成像，在场发射超声额外的技术障碍阻止光路和振动的影响。然而，治疗中的应用刺激，每天只需要20分钟的事实表明，一阵刺激后的细胞行为的分析，很可能是富有成效的。
Disclosures
安德鲁·哈里森是的施乐辉英国有限公司的雇员。
Acknowledgments
这项工作得到了威康信托基金赠款088419 MDB和赞助施乐辉英国有限公司
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
References
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