Summary
このプロトコルは、接着斑の形成と膜貫通マトリックス受容体、シンデカン-4の関与を模倣することによってRac1の活性化を駆動する低強度パルス超音波による培養線維芽細胞の刺激を説明しています。このアプローチは、それによって治療法の改良の機会を提供する、細胞レベルで成功した臨床技術の調査を可能にします。
Abstract
多細胞生物において、細胞の挙動は細胞外マトリックスとの相互作用によって決定されます。細胞の遊走と増殖の調節から、分泌、さらに分化に行列係範囲の結果。これらの複雑なプロセスのそれぞれの基礎となる信号は、細胞の表面上の細胞外マトリックス受容体の分子間相互作用から生じる。インテグリンは原型の受容体であると機械的な細胞外マトリックスと細胞骨格の間のリンクと同様に、接着依存性のシグナル伝達カスケードのいくつかを開始することを提供しています。しかし、それは追加の膜貫通受容体がインテグリン下流そのものと信号の両方を調節するインテグリンと一緒に機能していることをますます明らかになっています。これらの例の中で最もエレガントなフィブロネクチンへの接着時のα5β1インテグリンと協力して貫通プロテオグリカン、シンデカン- 4である。in vivoモデルdemonstr でシンデカン-4ノックアウトマウスは非効率的な線維芽細胞への移行1,2による治癒遅延を示すように、シンデカン- 4シグナリングの重要性を食べました。野生型動物では、傷に向かって線維芽細胞の移行は、破損した毛細血管からリークとは、負傷した組織内のマクロファージによって堆積されているフィブロネクチンの出現によってトリガされます。したがって、フィブロネクチン - 依存性のシグナル伝達を強化し、修復プロセスを加速させることができる戦略を発見することに大きな関心があります。
インテグリン媒介およびフィブロネクチン - 依存性のシグナル伝達のシンデカン-4を介したコンポーネントの組換えフィブロネクチンフラグメントによる刺激細胞で分離することができます。インテグリンの関与は、細胞接着に必須であるが、特定のフィブロネクチン - 依存性の信号は、シンデカン - 4で規定されている。シンデカン-4活性化Rac1の突出信号3は 、焦点にインテグリン配布1、などビンキュリンなど細胞骨格分子のトリガ募集を引き起こし、癒着4、それによって方向性のある移動3を誘導する 。我々はこのようなシグナルを活性化するための代替戦略を見て、低強度パルス超音波（LIPUS）がシンデカン- 4婚約5の効果を模倣できることを見出した。このプロトコルでは、我々は、1 kHz（ 図1）でパルスで30 MW / cm 2と 、1.5 MHzの超音波検査方法は、Rac1の活性化と接着斑の形成を誘導する培養中の線維芽細胞（ 図2）に適用することができますについて説明します。このパラメーターの組み合わせは、臨床骨折修復6の加速のための最も効果的であることが判明しているように超音波刺激は、20分の最大値に適用される。メソッドは、シンデカン-4の関与なしにα5β1インテグリンを、従事する組換えフィブロネクチンフラグメントを使用しており、線維芽細胞による追加的な行列の沈着を阻止するシクロヘキシミドによるタンパク質合成の阻害を必要とします。、正の効果O修復機構のF超音波はよく7,8に記載されていると、文化の中で超音波の分子の影響を理解することによって我々は臨床転帰を改善する治療技術を改良することができるはずです。
Protocol
1。マトリックスリガンドでコーティング表面
- 超音波は、個々の皿として、または6ウェルプレートのいずれかとし、3.5 cmのウェルに細胞に適用されます。生化学的アッセイ、直接プラスチックの上にコートリガンド。免疫蛍光法では、沸騰ガラスは各ウェルの底に3つのMilliQ水で時間と場所4カバースリップをカバースリップ。
- ガラス表面は、効率的な配位子のコーティングを確保するために誘導体化しなければなりません。 1 mMのPBSでのスルホ-m-マレイミドベンゾイル-N-hydrosuccinimideエステルを溶解する。各ウェルに2ミリリットルを追加し、室温で30分間インキュベートします。
- PBSで誘導体化表面を3回洗浄します。
- コートのいずれかの誘導体化ガラスやインテグリンリガンドと未処理のプラスチック。各ウェルに+とMg 2 +のCa 2を含むPBSに溶解し、10 ug / mlのインテグリンligand9 2mlを、適 用し、4℃で一晩インキュベート℃、
- °C 13分間85にPBSに溶解し、1％BSAを、加熱することにより、BSAをmonoparticulate準備します。許可する冷却し、0.45μmフィルターを通過します。
- 30分間monoparticulate BSAを含むPBSとブロックとリガンド被覆表面を3回洗浄します。
2。細胞の調製
- 実験を通して行列環境を制御するには、タンパク質合成を2時間で80％コンフルエントに線維芽細胞から25μg/ mlのシクロヘキシミドの添加によりブロックされる必要があります。
- PBSでシクロヘキシミド処理した細胞をリンスし、0.5 mg / mlのトリプシン/ EDTAを用いて培養フラスコから取り外します。
- 5分間、500分の1 gで遠心分離により収穫剥離した細胞。
- DMEM/25 mMのHEPES、25μg/ mlのシクロヘキシミドで細胞を再懸濁します。
- haemocytometerを使用して、懸濁液の細胞密度をカウントし、105ミリリットル-1に希釈します。
- 表面のインテグリンを回復するために20分間37℃で細胞をインキュベートします。
- PBSでリガンドでコーティングされた、BSA-ブロックのウェルを3回すすいでください。
- 各ウェルに細胞懸濁液のシード2ミリリットル。
- アロ37℃で2時間分散させるワット細胞℃、5％CO 2。
3。超音波刺激
- 37℃に超音波エミッタアレイとカップリングゲルを温める
- 各エミッタにゲルをカップリングの豆粒大のブロブを適用します。
- 各エミッタは超音波インジケータダイオード検出器を用いて機能していることをテストします。
- エミッタアレイ上のウェルに配置します。 °C、5％CO 2、37の配列を返すと、温度が10分間平衡化することができます。
- 超音波信号に切り替えます。
- 超音波信号は、治療計画を模倣し、20分後に無効になります。短い刺激時間が必要な場合は、プレートを適切なポイント時に配列から削除する必要があります。すべてのケースで負の対照として刺激を受けていないプレートを使用しています。
4。免疫蛍光法により接着斑の解析
- 接着斑の形成の分析のために、20分間の超音波信号を適用するそして構造は37℃、5％CO 2で細胞を維持することによって、さらに40分のために開発することができます。
- 培地を吸引除去し、PBSで2ミリリットルを4％パラホルムアルデヒドを適用することによって細胞を固定します。室温で14分間インキュベートします。
- パラホルムアルデヒドを吸引除去し、剪断力の発生を避けるために、井戸の縁の下静かにPBSを適用し、PBSで3回すすいでください。
- 3.5センチメートルからも、その後の免疫蛍光染色のために24ウェルプレートに各カバースリップを転送します。
- 24ウェルのそれぞれにPBSに0.5 mlの0.1 Mグリシンを適用することにより、残留ホルムアルデヒドを消す。室温で20分間インキュベートします。
- グリシンを吸引除去し、PBSで3回すすいでください。
- トリトンX-100 PBSで（w / v）の0.5パーセント0.5ミリリットルを適用することにより、細胞をPermeabilise。室温で4分間インキュベートします。
- トリトンX-100を吸引除去し、PBSで3回すすいでください。
- PBSに0.5ミリリットル3％（w / v）のBSAを適用することにより、ブロックします。 4＆Dで一晩インキュベートする。例えば、C.
- BSAブロックで1:400に希釈しHVIN-1抗体とビンキュリン含有接着斑を染色する。室温で1時間インキュベートする。
- PBSで3回すすいでください。
- フルオロフォア（DyLight 488）標識二次抗体（1:200希釈）とBSAブロック内のTRITC標識ファロイジン（1:200希釈）で染色アクチンを適用します。室温で30分間インキュベートします。
- PBSで、一度水で3回すすいでください。
- ゴールド封入を延長使用して、反転位置でスライドガラス上にマウントします。
5。プルダウンアッセイによるRac1の活性化の定量化
- Rac1の活性化の分析のために、37細胞に20分間の超音波信号を適用します°C、5％CO 2。 20分以上応答時間を評価する際に、20分間超音波信号を適用し、応答が開発できるように残り時間を37°C、5％CO 2で細胞を維持します。
- よくメディアや場所を吸引氷の上だ。 2ミリリットルの冷PBSと吸引でウェルを洗浄します。残ったPBSを徹底的に吸引に続いて1分間に傾い井戸を残していないことを確認します。
- ウェルあたり35μlの溶解バッファー（10％グリセロール、20mMのHEPES pH7.4で、140mMのNaCl、1％NP40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、4 mMのEGTA、4mMのEDTA、1×コンプリートプロテアーゼ阻害剤）と氷上で細胞を溶解します。この例では、6ウェルの細胞ライセート210μlを生成するために時点ごとに使用されています。より多くのまたはより少ない井戸が使用できますが、ライセート中の総体積は約200μlを合計する必要があります。
- 完全な細胞溶解を確保し、プールにライセートを可能にするために1分間傾け井戸を残すためにセルスクレーパーで細胞を十分に落とす。
- ペレット、細胞残渣に4°Cで2分間21000氷冷1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（同じ治療体制からプーリング溶解）とスピン×gにライセートを移します。
- 溶解バッファー130μlと25μlのPAK-GLUTを含む1.5 mlのマイクロチューブは氷冷にライセート180μlを転送athioneアガロースビーズ10。その後のゲル分離のための-20°Cで、残りの粗溶解物を保持します。
- 4℃で40分間チューブを回転させることによってPAK-グルタチオンアガロースビーズ上のアクティブなRac1のキャプチャ℃に
- 収穫アガロースビーズは、2000年の遠心分離によりコンジュゲート×gで1分間、4℃
- 洗浄ビーズは、各洗浄後、2000X gと廃棄上清を遠心分離によりビーズを収穫、500μlの溶解緩衝液で3回コンジュゲート。慎重に200μlのピペットを用いて残りの溶解洗浄バッファーを削除します。
- 5分間振とうヒートブロックで85℃35μlのSDS-PAGEローディングバッファーとインキュベート°Cを追加することにより、各サンプルを溶出します。 1分間21000×gで遠心分離によりビーズを除去します。
- SDS-PAGEによりビーズ溶出液を解決し、Rac1のためのニトロセルロースとプローブに転送します。
6。代表的な結果
このプロトコルでは、ビンキュリン、汚れの誘導を説明するED焦点癒着と超音波によるRac1の活動。焦点接着実験では、ベースラインの位置がα5β1インテグリンのリガンドに広がる線維芽細胞は第二フィブロネクチン受容体、シンデカン-4、限りビンキュリン含有癒着（ 図3A）を形成しないことですが添加することにより行っています可溶性リガンド（ 図3B）3,4。しかし、超音波による刺激は、超音波刺激はフィブロネクチン依存シグナル伝達経路5の特定のコンポーネントに置き換えることができたことを示す、シンデカン-4（ 図3C）との係合と同程度に接着斑の形成を誘導する。このプロトコルのキーのハードルは覚せい剤の非存在下での接着斑の形成を排除されています。シクロヘキシミドによるタンパク質合成の不完全な阻害は、auto-刺激に対する細胞のために十分であるマトリックスの沈着をできるようになります。セルの過密は、低レベルの接着斑構成体につながることができますnおよび細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス間の接点間のクロストークなどの超音波に反応不良は、単一の刺激を分離するために設計された実験が複雑になります。基本的なアッセイの開発として、我々はシンデカン-4（ 図4）欠けている線維芽細胞を繰り返し同じ実験を、示しています。これらの線維芽細胞は、まだ超音波（ 図4C）に対応するが、シンデカン- 4リガンド（ 図4B）に応答しなかった。 Sdc4を用いた実験- / -繊維芽細胞では、超音波は確かに特定のフィブロネクチン受容体の必要性をバイパスすることができますを示し、単純なプロトコルは、シグナル伝達経路に関する追加情報を得るために開発する方法を示しています。
生化学的な実験のために我々は、超音波は、デル·ポソら 10記載の方法を適応したものです。プルダウンアッセイを用いて、Rac1の活性化を誘導することができますを示しています。アクティブRac1の0、10、30とini 60分後の降水量超音波刺激のtiationは、ベースライン（ 図5）に戻る前に、10〜30分でそのRac1の活性ピークを明らかにする。ビンキュリンの粗ライセートをウェスタンブロッティングには時間がポイントの間に相当の負荷を確実にします。その結果、シンデカン- 4 3の係合によりRac1の活性化に似ていますが、フィブロネクチンによる活性化よりも若干長引くです。したがって、8月10日リピートは、通常、重要なデータを達成するために必要とされています。 Rac1の活性化は、接着斑の形成への細胞のコミットメントの責任であり、初期の接着斑は、Rac1の活性化と一致、10〜30分で形成し始める。一度開始され、これらの癒着は、 図3と図4に示すように、大規模な接着斑に成熟していきます。
図1超音波形。超音波は断続的に1.5 MHzの信号を含む、低振幅（30 MW / CM <のために> 2、空間平均、時間平均のsup）は加熱効果がありません。
図2超音波による細胞の調製と刺激のためのワークフローの模式図。
図3。線維芽細胞の接着斑形成の超音波誘導。線維芽細胞は、フィブロネクチン（B）や超音波（C）のシンデカン-4 - 結合フラグメントで刺激する前に、フィブロネクチンのインテグリン結合フラグメント（）上に広げた。 60分の刺激後、細胞を固定したビンキュリンとアクチンを染色し、落射蛍光とにより撮像された。バー=10μmである。
図4。シンデカン-4を欠損線維芽細胞の接着斑形成の超音波誘導。
図5超音波によるRac1の活性化。細胞は、0、10、30、時点ごとに使用される6ウェルで60分間刺激した。量GTP-Rac1のRac1のプルダウンアッセイ時間コースからのサンプル中に存在するウェスタンブロット（上画像）に抗Rac1の抗体とインキュベートすることにより可視化した。バンド強度の定量化（8-10の平均は複製）Rac1の増加を明らかにctivityは60分（グラフ）でベースラインのレベルに戻る前に、10〜30分の超音波信号から得られる。エラーバーはSEMを表す
Discussion
このプロトコルでは、我々は通常、人間の患者に適用される治療は、細胞ベースの実験で使用することができる方法について説明します。究極の目標は、治療が洗練されたことができるように超音波作用の分子機構を理解することです。このプロトコルでは、モデル細胞系としてマウス胚繊維芽細胞（MEF）を使用していますが、超音波は、初代ヒト包皮線維芽細胞5、間葉系幹細胞、骨芽細胞および軟骨細胞6で有効であることが判明してされています。ここでは、例の生化学的アッセイとしてRac1の活性化を使用していますが、方法は同様にタンパク質のリン酸化や免疫沈降によるタンパク質複合体の形成の調節をテストするために使用することができます。免疫例では、接着斑形成に効果の超音波を発揮しますが、分子の再配分を検討することができます。たとえば、一つはproteのcolocalisation、形質膜への細胞質因子の補充をテストすることができます人身売買の小胞のプラグインまたは有糸分裂紡錘体の組織に超音波の効果を調べる。これまでのところ我々は、自身がコラーゲンで、または成長因子の存在下で超音波は、複雑な環境下で細胞の挙動にどのような影響を与えるかの画像を構築するためにテストすることができ、細胞に超音波の効果により、フィブロネクチン - 依存性経路をテストするために閉じ込められたことをより多くの密接にin vivoでの状況は似ています。大きな課題は、エミッタの存在は超音波検査現在、追加の技術的な障害からの光パスや振動を遮断するタイムラプスイメージングを使用して、超音波の効果をテストすることになります。しかし、治療への応用は、日あたりの刺激のわずか20分を必要とするという事実は、刺激のバースト後の細胞の挙動の分析がよく生産性を得ることを示唆している。
Disclosures
アンドリュー·ハリソンは、スミス·アンド·ネフュー英国限定の従業員です。
Acknowledgments
この作品は、スミス·アンド·ネフュー英国株式会社によってMDBとスポンサーにウェルカムトラスト助成金088419によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
References
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