Två metoder för heterokaryonbildning att upptäcka HCV Restriction Faktorer
Summary
Vi beskriver två metoder för villkorlig<em> Träns</em>-Komplettering av hepatit C-virus (HCV) montering och slutförandet av hela virusets livscykel, som är beroende av heterokaryonbildning. Dessa tekniker är lämpliga för att screena för cellinjer som uttrycker dominerande restriktionsställen faktorer, som förhindrar produktion av infektiöst HCV avkomma.
Abstract
Hepatit C-virus (HCV) är ett hepatotropiskt virus med en värdspektrum begränsad till människor och schimpanser. Även om HCV RNA-replikation har observerats i humana icke-hepatiska och murin cellinjer, var effektiviteten mycket låg och lång sikt, urvalsförfaranden med HCV repliken konstruerar uttrycker dominerande antibiotika valbara markörer 1-5. HCV in vitro-forskning är därför begränsad till humana hepatomcellinjer tillåtande för virus in och färdigställande av virusets livscykel. På grund av HCV smala arter tropism, finns det ingen immunkompetenta litet djur modell tillgänglig som upprätthåller hela HCV-replikationscykeln 6-8. Ineffektiv replikation av HCV i icke-humana celler, t.ex. från mus är troligen beroende på brist på genetisk inkompatibilitet av väsentliga faktorer värdceller beroende och / eller uttryck av restriktionsställen faktorer.
Vi undersökte om HCV utbredning hämmas av dominerande restriktion FActors i antingen humana cellinjer härledda från icke-levervävnader eller i muslever cellinjer. För detta ändamål har vi utvecklat två oberoende villkorliga trans-komplementering metoder som bygger på somatisk fusion. I båda fallen är avslutad virusreplikation cykeln endast möjligt i heterokaryoner. Följaktligen indikerar framgångsrik träns-komplementering, som bestäms genom mätning av de novo-produktion av infektiösa virala avkomman, frånvaro av dominanta begränsningar.
Specifikt subgenomiska HCV replikoner bär en luciferas transgen transfekterades i mycket tillåtande humana hepatomceller (Huh-7.5-celler). Därefter dessa celler samodlades och fuseras till olika humana och murina celler som uttrycker HCV-strukturella proteiner kärna, höljet 1 och 2 (E1, E2) och proteiner tillbehöret p7 och NS2. Förutsatt att cellfusion initierades genom behandling med polyetylen-glykol (PEG), frigörs den kultur smittsam virussjukdom paARTIKLARNA som infekterats naiva celler i en receptor-beroende sätt.
För att bedöma påverkan av dominerande restriktioner hela virusets livscykel, inklusive cellinmatning, RNA översättning, replikering och virus montering tog vi fördel av en human lever cellinje (Huh-7 LUNET N-celler 9) som saknar endogent uttryck av CD81, en viktig post faktor HCV. I frånvaro av ektopiskt uttryckt CD81, dessa celler är i huvudsak okänsliga för HCV-infektion 10. Viktigt vid samtidig odlas och smält med celler som uttrycker människans CD81 men saknar minst en annan avgörande cellinmatning faktor (dvs. SR-BI, CLDN1, OCLN), endast de resulterande heterokaryoner visa den fullständiga uppsättningen av HCV inträde faktorer förutsättning för infektion. Därför att analysera om dominerande begränsning faktorer undertrycka avslutad HCV replikationscykeln, smält vi LUNET N-celler med olika celler från människa och mus ursprung som uppfyller ovan nämnda critERIA. När samodlade celler transfekterades med en mycket fusogena virala höljesproteinet mutant av prototypen skumvirus (PFV 11) och därefter med infektiösa HCV-partiklar (HCVcc), var de novo-produktion av infektiöst virus observerades. Detta tyder på att HCV framgångsrikt slutfört sin replikering cykel i heterokaryoner vilket utesluter uttryck för dominerande begränsning faktorer i dessa cellinjer. Dessa nya villkorliga trans-komplementering metoder vara användbara för att visa en stor panel av cellinjer och primära celler för uttryck av HCV-specifika dominerande begränsning faktorer.
Protocol
Discussion
Vi presenterar två metoder för att inducera heterokaryonbildning i odlade celler för analys av dominanta negativa restriktioner som hindrar HCV-replikation. Med användning av dessa förfaranden har vi inte närvaron av en dominerande konstitutivt uttryckt eller virus-inducerad faktor i olika humana icke-lever och i murina lever cellinjer. Den första analysen analyseras främst om begränsning faktorer hindrar HCV montering och frisättning av infektiös avkomma. Eftersom det i detta fall förpackningen cellerna sm?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för Takaji Wakita och Jens Bukh för JFH1 och J6CF isolat, respektive. Dessutom har vi tackar Charles Rice för Huh-7,5 celler och 9E10 antikroppen, Steven Foung för E2-specifik antikropp CBH-23, och alla medlemmar i avdelningen för experimentell virologi, Twincore för hjälpsamma förslag och diskussioner.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
| DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
| Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
| Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
